納米羥基磷灰石/硫酸鈣復合人工骨順鉑緩釋系統(tǒng)注射液的制備與研究*

鄭燕科，張春強，湯燕飛，余佳明，江 摩，湯善華(解放軍第184醫(yī)院,江西鷹潭 335000)

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·論 著·

納米羥基磷灰石/硫酸鈣復合人工骨順鉑緩釋系統(tǒng)注射液的制備與研究*

鄭燕科，張春強，湯燕飛，余佳明，江 摩△，湯善華(解放軍第184醫(yī)院,江西鷹潭 335000)

目的 研制可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG順鉑釋藥系統(tǒng)，為骨轉移瘤提供新型的局部藥物緩釋系統(tǒng)。方法 α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG載順鉑制成可注射用α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum緩釋微球，研究其結構、釋藥特性、可注射性以及力學性能。結果 (1)第1、3、5、7天緩釋微球的釋藥濃度分別為97.5、90.7、83.2、68.5 μg/mL，第7天后趨于穩(wěn)定。(2)可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG順鉑釋藥系統(tǒng)在液固比為0.7時可注射性強，與此同時緩釋藥系統(tǒng)隨著液固比的增大凝固時間延長。結論 α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG順鉑釋藥系統(tǒng)具有良好的注射性能和緩釋作用。

α-半水硫酸鈣； 順鉑； 局部藥物緩釋系統(tǒng)

局部藥物緩釋系統(tǒng)(DDS)因其能在局部達到較高的藥物濃度，同時血藥濃度低，不良反應小，為治療骨轉移瘤提供了有效的治療用途[1-3]。羥基磷灰石(HA)作為新型生物材料問世以來，引起了材料學科和醫(yī)學界的廣泛興趣。HA因其化學成分和晶體結構與人體骨骼組織的主要無機礦物成分基本相同，引入人體后不會產生排異反應，故其作為骨修復替代材料在國內外廣泛應用[4]。其已被動物實驗及臨床研究證實具有無毒、無刺激性、良好的生物活性、生物相容性及骨傳導性、較高的機械強度及化學性質穩(wěn)定等特點[5]。而納米級羥基磷灰石(nano-HA)與半水硫酸鈣(CSH)復合體作為一種新型骨修復材料，無需二次手術其可行性已經得到證實[2]。本研究采用具有生物活性的nano-HA作為載體，外包裹生物相容性好且可以降解的聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚體/聚乙二醇(PHBV/PEG),承載順鉑(cis-platinum)，制成nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球，再將nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum與α-CSH復合，作為人工骨材料，對其注射性能、凝固時間、藥物釋放等進行研究，以了解其實際應用的可行性和科學性。

1 材料與方法

1.1 材料 α-CSH(來自Sigma公司，γ射線照射滅菌)、二水硫酸鈣(CSD)、nano-HA 晶體(南京海泰納米材料有限公司)，復合材料以CSD等為促凝劑，以生理鹽水作為固化液，液/固比為0.8，α-CSH以水為固化液，液固比為0.36。聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物(PHBV)、聚乙二醇(PEG)購自華南理工大學材料學與工程學院。

1.2 方法

1.2.1 nano-HA-cis-platinum的制備 以質量比2∶1取nano-HA、cis-platinum，均勻混合，加入適量去離子水，超聲波分散25 min，在26 ℃磁力攪拌72 h。用去離子水離心洗滌3次，漿液于-80 ℃凍干，磨成粉末，得白色凍干粉nano-HA-cis-platinum[6]。

1.2.2 載藥nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球的制備 將nano-HA-cis-platinum白色凍干粉分散于含PHBV的二氯甲烷中(凍干粉與PHBV的質量比為1∶4),并加入PEG 20000(PEG20000和PHBV的質量比為2∶1)。然后迅速加入外相水中，其中含0.4%甲基纖維素(4 g/L w/v)，油相與水相的體積比為1∶10。劇烈攪拌至二氯甲烷完全揮發(fā)，以4 000 r/min離心15 min，過濾，水洗，收集固體冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用[7]。

1.2.3 電鏡觀察 將少量nano-HA、nano-HA-cis-platinum、nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球加入無水乙醇溶液中震蕩15 min，然后將懸浮液移到帶微柵膜的銅網上，乙醇揮發(fā)。 用JEOL JEM-2100高分辨透射顯微鏡進行分析。nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球鋪于鋁箔的黏性表面，微球表面涂金，掃描電鏡觀察微球大小和表面形態(tài)。

1.2.4 nano-HA載藥效果的測定以及復合材料體外釋藥實驗 取cis-platinum、純nano-HA以及載藥nano-HA各20 mg的樣品，溶于1 mL的二氯甲烷，加入5 mL的PBS溶液劇烈震蕩10 min，靜置1 h，然后取上清液，衍生法紫外100～400 nm全波段掃描，先確定cis-platinum的特征吸收峰為254 nm，再對比純nano-HA以及載藥nano-HA在254 nm處是否存在差異，以確定cis-platinum是否已經載入nano-HA。在cis-platinum的特征吸收峰處運用紫外分光光度計(UV)檢測不同濃度cis-platinum的吸光度，并制作標準曲線和回歸方程。將制得載藥復合材料90 mg室溫下浸泡于20 mL生理鹽水中，浸泡24 h。吸除浸出液，用PBS沖洗3次，更換PBS液，繼續(xù)浸泡。于第1、3、5、7、10、14、21、28天分別取樣，每次取5 mL浸泡液作為檢測樣品，同時加入5 mL新的生理鹽水，用UV檢測計算釋放藥物的質量并繪制釋藥曲線。

1.2.5 可注射α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的制備 取20 mL無菌注射器，樣品分為兩組，載藥組和未載藥組。1.0 g nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球或者1.0 g nano-HA/PHBV-PEG微球，1.0 g α-CSH，0.05 g CSD。以生理鹽水為固化液，并按液固比加入固化液并攪拌，加入固化液開始計時。迅速攪拌均勻，1 min將漿體注入模具內，并按照相關標準進行評價材料經過注射器的注射性能，同時評價樣品在不同液固比(mL/g)下的注射性能[8]。液固比值分別設定如下：載藥組0.3,0.4,0.5,0.6,0.7；未載藥組0.4,0.5,0.6,0.7，0.8。30 s注射1次，當漿液在注射器上無法注射時定義為凝固時間。

1.2.6 釋放曲線繪制 以標準曲線計算各時間點藥物濃度，用GraphPad Prism 5繪制nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum釋藥濃度與時間關系曲線。

1.2.7 人工骨材料注射效果評價標準 人工骨材料注射效果評價標準分為佳、可、勉強、差和極差5個等級。佳：注射順利穩(wěn)定，材料流暢順利通過針頭；可：注射屬順利但需要施加一定推助力；材料穩(wěn)定通過針頭；勉強：需要較大推助力方可注射，材料不能穩(wěn)定通過針頭；差：需要大力方可將材料從針筒推出，材料在針管中頻繁受阻，注射流量極不穩(wěn)定；極差：材料很難注射或完全無法注射。

2 結 果

2.1 電鏡觀察結果 透射鏡下可見nano-HA為納米相晶體顆粒，尺寸為30～60 nm(圖1)。

圖1 nano-HA呈短棒狀 (透射電鏡200K)

nano-HA-cis-platinum由于晶體的凝聚和表面吸附cis-platinum以及cis-platinum顆粒疊加在一起形成二次顆粒大小在100～300 nm，平均粒徑為199.5 nm(圖2)。

注：表面吸附大量cis-platinum。

圖2 nano-HA-cis-platinum 呈晶體自然凝聚狀態(tài)

注：A為 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球(掃描電鏡×500);B為高分辨透射顯微鏡 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum形態(tài)；C為PHBV-PEG cis-platinum微球。

圖3 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球與PHBV-PEG cis-platinum微球形態(tài)

高分辨透射顯微鏡以及掃描電鏡下可見nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum微球大小均勻，表面形態(tài)一致，為多孔皺縮結構，平均粒徑為55.4 nm，PHBV-PEG形成緩釋膜。微球破裂后大微球里面有大量小微球，小微球平均粒徑為8.1 nm(圖3)。

2.2 復合材料體外釋藥效果測定 經實驗證實cis-platinum的特征吸收峰在254 nm，而未載藥的nano-HA在此處沒有特征吸收峰(圖4)。

圖4 cis-platinum的紫外吸收光譜

在254 nm處測定10、20、40、60、80、100 μg/mL cis-platinum的吸光度，得到cis-platinum的標準曲線，并得其回歸方程Y=0.013 8X+0.212，R2=0.982(X為樣品濃度，Y為吸光度)(圖5)。

圖5 cis-platinum的標準曲線

第1、3、5、7天緩釋微球的釋藥濃度分別為97.5、90.7、83.2、68.5 μg/mL，第10天后趨于穩(wěn)定，體現出緩釋微球良好的緩釋性能,見圖6。

圖6 nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的釋藥曲線

項目未載藥組(mL/g)0．40．50．60．70．8載藥組(mL/g)0．30．40．50．60．7注射性能差勉強勉強可佳差差勉強可佳凝固時間(min)35612232371525

2.3 注射性能以及凝固時間 生理鹽水作為固化液，對于未載藥組，液固比(mL/g)為0.4時不能注射，而液固比為0.5、0.6時可以勉強注射，為0.7、0.8時可以注射，0.8時最佳。對于載藥組而言，液固比(mL/g)為0.3、0.4時不能注射，0.5時勉強可以注射，0.6、0.7時可以注射，0.7時最佳。凝固時間隨著液固比的變大而變長。見表1。

3 討 論

α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG-cis-platinum釋藥系統(tǒng)以α-CSH為支架，nano-HA為載藥核心，外包裹可生物降解的PHBV及PEG高分子化合物而形成的，其較一般的局部藥物緩釋系統(tǒng)有不同的特性，良好的藥物緩釋功能，藥物爆釋不明顯[9]。這是由其結構及組成所決定的。nano-HA//PHBV-PEG-硫酸慶大霉素微球存在大微球包裹小微球的結構，形成了多級緩釋膜，膜表面存在大小不等的微米級或納米級的孔隙[10]，保證水分的進入和藥物的稀釋；nano-HA的表面效應，吸附藥物能力強；nano-HA尺寸效應，nano-HA之間納米級通道；外包裹降解可調控的高分子聚合物PHBV及PEG，并以α-CSH為支架[11]。

HA和CSH都是公認的優(yōu)良成骨材料。有實驗證明CSH/HA復合人工骨具有良好的微孔性是各種蛋白藥物的合適載體[6]。1987年Frame等嘗試將它們復合以改善單一HA材料注射性能不佳的缺點。實驗發(fā)現，兩材料復合用于犬下頜骨缺損修復，獲得了協同的成骨活性：這種復合材料不僅塑形性和充填性滿意，其成骨性能甚至與HA自體骨相當[7]。Shigeru等將這種復合物注射于兔脛骨骨髓內，4周后即見新骨形成，8周已十分明顯。研究所用的復合人工骨系nano-HA與CSH組成，nano-HA的晶體尺度與天然骨接近，具有更好的理化及生物學性能，動物實驗已發(fā)現該復合物降解時間適當，具有良好的成骨活性[9]。

本研究研制了一種具有α-CSH/nano-HA與PHBV/PEG復合體材料的藥物緩釋系統(tǒng)，這樣的藥物緩釋系統(tǒng)使得順鉑的釋藥時間延長，從nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum的釋藥曲線可以看出藥物突釋不明顯。而且在合適的液固比下，藥物具有良好的注射性能。與普通的nano-HA/PHBV-PEG緩釋系統(tǒng)相比，本研究的緩釋系統(tǒng)采用α-CSH/nano-HA復合人工骨，使得順鉑緩釋系統(tǒng)具有了比較良好的成骨活性。本研究使傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物順鉑兼具藥物緩釋性能以及緩釋系統(tǒng)的良好成骨性能，為骨轉移瘤的治療提供了更為廣闊的應用前景。

[1]Fu J,Shen J,Gao G,et al.Natural polyphenol-stabilised highly Cross linked UHMWPE with high mechanical properties and low wear for joint implants[J].J Mater Chem B,2013,23(11):4727-4735.

[2]Luciani A,Coccoli V,Orsi S,et al.PCL microspheres based functional scaffolds by bottom-up approach with predefined microstructural properties and release profiles[J].Biomaterials，2008,29(36):4800-4807.

[3]WangL,WengL,SongS,etal.Hydrothermalsynthesisofhydroxyapatitenanoparticleswithvariouscounterionsastemplates[J].JCeramicSocietyofJapan,2010,118(12):1195-1198. [4]Wong KL,Wong CT,Liu WC，et al.Mechanical properties andin vitro response of strontium-containing hydroxyapatite/polyetheretherketone composites[J].Biomaterials,2009,30(23/24):3810-3817.

[5]王雪毓,陳玲,蘇健裕，等.高直鏈玉米淀粉對聚己內酯組織工程支架結構和性能的影響[J].華南理工大學學報,2009,37(12):18-22.

[6]王楊,胡金蓮.抗感染納米羥基磷灰石局部藥物緩釋微球的研制及體外釋藥實驗[J].家庭醫(yī)藥：醫(yī)藥論壇,2010,2(11):818-820.

[7]章柏平，湯善華，張立，等.可塑性納米羥基磷灰石/聚羥基丁酸酯-羥基戊酸酯共聚物-聚乙二醇釋藥系統(tǒng)治療兔骨髓炎[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(21):3871-3876.

[8]楊春麗，劉金輝，蔡旗.熱毒寧注射液聯合鹽酸氨溴索注射液佐治嬰幼兒毛細支氣管炎的療效觀察[J].中國醫(yī)藥指南,2013，11(33)：199-200.

[9]曹耿華,畢衍澤,陳民芳,等.骨折內固定用新型Mg-Zn-Ca/HA復合材料的成分、組織結構與性能[J].稀有金屬材料與工程,2013,42(8):1633-1637.

[10]Peng QY,Cong PH,Liu XJ,et al.The preparation of PVDF/clay nanocomposites and the investigation of their tribological properties[J].Wear,2009,266:713-720.

[11]Kim HJ,Kim UJ,Kim HS,et al.Bone tissue engineering with premineralized silk scaffolds[J].Bone，2008,42(6):1226-1234.

Preparation and study of α-CSF-nano-(HA)/ PHBV-PEG cis-platinum sustained release system injection*

ZHENGYan-ke,ZHANGChun-qiang,TANGYan-fei,YUJia-ming,JIANGMo△,TANGShan-hua

(184HospitalofPLA,Yingtan,Jiangxi335000,China)

Objective To research and prepare of α-calcium sulfate hydrate(CSH)-nano-hydroxyapatite(HA)/PHBV-PEG cis-platinum drug release system to provide the new type local drug sustained release system for metastatic bone tumor.Methods Cis-platinum was loaded into n-HA by the ion exchange method.The drug loaded n-HA was mixed with CSH(1∶1) and coated with compomer poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)(PHBV) and polyethylene glycol(PEG).The injectable α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum sustained release microspheres were prepared.The release characteristics,injectability and mechanical property were researched.Results (1) The drug release concentration of the sustained release microspheres on 1,3,5,7 d the cis-platinum concentration was 97.5,90.7,83.2,68.5μg/mL respectively,and then the concentration trended to be stabilized.(2)When the liquid/solid ratio was 0.7,the injectable α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum drug delivery system has a strong injectability.At the same time the coagulation time was extended along with the increase of liquid/solid ratio.Conclusion The α-CSH-nano-HA/PHBV-PEG cis-platinum drug delivery system has the better in vitro releasing effect and injection property.

α-calcium sulfate hemihydrate； cis-platinum； drug delivery system

南京軍區(qū)科技創(chuàng)新課題(08Z017);江西省科技計劃項目(2012BBG70038)。

鄭燕科，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事骨腫瘤基礎與臨床研究?！?/p>

，Email：jiangmoqq123@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.008

A

1672-9455(2015)01-0019-03

2014-04-24

2014-09-19)