丙型肝炎病毒基因型與慢性丙型肝炎患者病情嚴重程度之間關(guān)系的研究*

喬 斌，汪 明，袁樂永，熊 格，李 艷(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，武漢 430060)

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·論 著·

丙型肝炎病毒基因型與慢性丙型肝炎患者病情嚴重程度之間關(guān)系的研究*

喬 斌，汪 明，袁樂永，熊 格，李 艷△(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，武漢 430060)

目的 分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型與慢性丙型肝炎患者病情嚴重程度之間關(guān)系，為慢性丙型肝炎患者的臨床診斷和治療提供依據(jù)。方法 采用直接測序法對HCV進行基因分型，并測量患者未治療前HCV-RNA水平、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、清蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)、血小板計數(shù)(PLT)水平。結(jié)果 共對321株HCV進行基因分型，其中1a型占1.2%，1b型占78.5%，2a型占8.7%，3a型占2.2%，3b型占4.7%，6a型占2.8%，6b型占1.9%。HCV1型患者ALT、HCV-RNA、AST/PLT比值指數(shù)(APRI)水平明顯高于非1型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.009，<0.01，0.036)；而AST、ALB、Hb、PLT、AST/ALT水平兩者并無明顯差異。結(jié)論 HCV1型患者HCV-RNA水平高于非1型患者，肝臟功能損害較非1型患者嚴重。

丙型肝炎病毒； 基因型； 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； 血小板計數(shù)

丙型肝炎是一種呈全球性分布的傳染性疾病，2012年WHO統(tǒng)計大約有1.5億人感染丙型肝炎病毒(HCV)，其中75%～85%發(fā)展為慢性感染，每年有超過35萬人死于HCV感染相關(guān)的肝臟疾病[1-2]。我國慢性丙型肝炎感染患者大約有(2 000～5 000)萬，約占世界所有丙型肝炎患者的15%～30%[3]。研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的HCV感染患者病情嚴重程度有所差異。本文對慢性丙型肝炎感染患者的病毒基因型及相關(guān)指標進行檢測分析，為慢性丙型肝炎患者的臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2011～2013年武漢大學(xué)人民醫(yī)院收治的321例慢性丙型肝炎初治患者，其中男180例，平均年齡(43.96±18.44)歲；女141例，平均年齡(50.77±12.20)歲。慢性丙型肝炎的診斷符合2004年《丙型肝炎防治指南》中的診斷標準[4]，所有納入患者入院之前均無系統(tǒng)的接受抗病毒治療，并且無其他疾病。

1.2 檢測方法

1.2.1 HCV基因分型檢測 HCV-RNA提取采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血漿TRIzol LS提取法，提取后的RNA使用Thermo公司的RevertAid?第一鏈cDNA Synthesis試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為隨機引物；測序引物forward primer 5′-TTA ACC ACA TCM RCT CCG TGT G-3′,reverse primer 5′-GTA CCT GGT CAT AGC YTC CGT RAA-3′，采用ABI公司3130XL測序儀檢測。測序結(jié)果與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)上的參考序列AF009606、AF271632和AF139594等進行比對分析，確定HCV基因型。

1.2.2 HCV-RNA定量檢測 HCV-RNA提取采用凱杰公司的QIAcube全自動核酸提取儀及配套試劑(凱杰careHCV RT-PCR Assay V1試劑盒)，使用羅氏LighterCycler480 PCR儀及凱杰careHCV RT-PCR Assay V2試劑盒進行HCV-RNA定量，線性范圍為1×103～5×107；定量結(jié)果超過線性范圍(>5×107)以5×107計算。

1.2.3 相關(guān)指標檢測 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、清蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)、血小板計數(shù)(PLT)水平檢測通過檢驗科常規(guī)生化儀(Olympus AU-5400；Simens ADVIA2400)和血細胞儀(Sysmex XE-2100)測量。

2 結(jié) 果

2.1 共對321例丙型肝炎患者的HCV進行基因分型，其中1a型4例，占1.2%；1b型252例，占78.5%；2a型30例，占8.7%；3a型7例，占2.2%；3b型15例，占4.7%；6a型9例，占2.8%； 6b型6例，占1.9%。見圖1。

2.2 256例HCV基因型1型患者與65例基因型非1型患者相關(guān)指標的比較 兩者在AST、ALB、Hb、PLT水平上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.471、0.597、0.835、0.378)；在ALT、HCV-RNA、AST/PLT比值(APRI)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.009、<0.01、0.036)。見表1。

表1 HCV基因型1型與非1型相關(guān)指標的比較±s)

注：HCV-RNA定量結(jié)果以對數(shù)值計算log10(HCV-RNA)。APRI：AST/PLT比值。

圖1 HCV基因型分布

3 討 論

HCV基因組呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，根據(jù)HCV基因組序列的差異程度，目前可將HCV分為6個主要基因型(30%～35%)、68個基因亞型(20%～25%)及若干分離株(5%～8%)和準種(1%～5%)[5-6]。我國大部分地區(qū)主要流行的HCV基因為1b型，其次為2a型，南方城市1b基因型感染率可達到90%以上，從南向北2a基因型逐漸增多。目前為止，我國尚未發(fā)現(xiàn)HCV基因型4或5型感染[4]。本研究通過對321例慢性丙型肝炎HCV基因分型發(fā)現(xiàn)，1b型為主要感染基因型，占78.5%；其次為2a型，占8.7%；向下依次為3b型占4.7%，6a型占2.8%，3a型占2.2%，6b型占1.9%，1a型占1.2%。由于不同HCV基因型的核苷酸序列存在差異，因此HCV不同基因型在感染性、致病力、對抗病毒治療的反應(yīng)性和地區(qū)群集等方面有著明顯的差異。本研究發(fā)現(xiàn)HCV 1型患者HCV-RNA水平明顯高于非1型患者(P<0.01)，而兩者的基礎(chǔ)狀態(tài)無明顯差別，ALB水平、Hb水平、PLT水平均無明顯差異。目前研究認為，HCV 1型病毒載量明顯高于非1型患者，這可能與HCV 1型具有更強的復(fù)制能力相關(guān)[7-8]。而病毒載量又與患者的抗病毒治療效果相關(guān)，低病毒載量常常更易獲得持續(xù)性病毒應(yīng)答(SVR)[9]。

肝臟代謝酶水平是反映肝臟組織損害的最靈敏指標之一，其中ALT、AST是應(yīng)用最多的兩個肝臟代謝酶，水平越高，肝臟組織損害程度越嚴重。本研究通過對HCV基因型1型和非1型患者血清ALT、AST水平進行比較分析，發(fā)現(xiàn)HCV基因型1型患者ALT水平明顯高于非1型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)，而AST、AST/ALT水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.471、0.15)。這可能由于ALT存在胞質(zhì)內(nèi)，肝細胞受到破壞更易進入血循環(huán)中而檢測到，而AST位于線粒體內(nèi)，需要進一步的破壞尚可釋放入血循環(huán)，并且慢性丙型肝炎患者肝臟損傷是慢性持續(xù)性的，這也可能導(dǎo)致ALT水平升高明顯，而AST水平升高不明顯。HCV基因型1型感染與肝炎的慢性化進程和嚴重的肝臟疾病有關(guān)，推測這與型特異性基因編碼的蛋白有較強的細胞毒作用有關(guān)。相關(guān)研究也表明，基因型1b在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中占絕大多數(shù)，同時多表現(xiàn)為血清ALT升高，提示易導(dǎo)致肝細胞損傷[10-11]。

APRI作為一個簡單、非侵入性指標用來反映慢性丙型肝炎患者肝臟纖維化及肝硬化程度。研究發(fā)現(xiàn)，APRI>1.5，肝臟呈現(xiàn)嚴重的纖維化改變；APRI>2.0，肝臟呈現(xiàn)肝硬化改變[12]。本試驗對發(fā)現(xiàn)HCV基因型1型患者APRI水平高于非1型患者，也從側(cè)面反映出基因型1型患者肝臟損害程度更加嚴重。

另外，有研究表明，HCV基因型1a、2a合并HBV感染的發(fā)生率較高，大部分急性肝炎患者為基因型1a；基因型3a感染與肝臟脂肪變的關(guān)系較為密切；基因型4感染易引起失代償性肝臟并發(fā)癥[13]。因此，丙型肝炎防治指南中推薦對丙型肝炎患者治療前，應(yīng)進行HCV基因分型，評估患者的病情，為患者制訂合適的治療方案，而且可以預(yù)測治療效果[14]。

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Relationship between HCV genotypes and severity degree of patients with hepatitis C*

QIAOBin,WANGMing,YUANLe-yong,XIONGGe,LIYan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To analyze the relationship between hepatitis C virus(HCV) genotypes and the severity degree of the patients with hepatitis C in order to provide the basis for the diagnosis and treatment of chronic hepatitis C(CHC).Methods The genotype of HCV was tested by the direct sequencing method,and the levels of HCV-RNA,ALT,AST,ALB,Hb,PLT,AST/ALT and AST to ptatelet ratio index(APRI) before treatment were determined.Results 321 strains of HCV were performed the genotyping,in which,1b,2a,3b,6a,3a,6b and 1a accounted for 78.5%,8.7%,4.7%,2.8%,2.2%,1.9% and 1.2% respectively.The levels of ALT,HCV-RNA,APRI in the patients with HCV genotype 1 were higher than those in the patients with non-genotype 1,the differences had statistical significance(P<0.01); while the levels of AST,ALB,Hb,PLT and AST/ALT had no statistical differences between the two groups.Conclusion The level of HCV-RNA in the patients with genotype 1 is higher than that with non-genotype1,and the liver damage is severer

HCV； genotype； ALT； AST； PLT

國家重點臨床?？平ㄔO(shè)項目(財社[2010]305號)。

喬斌，男，碩士，主要從事感染性疾病的分子診斷工作。△

，E-mail：liyan@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.002

A

1672-9455(2015)01-0004-02

2014-03-13

2014-08-01)