苯酚－硫酸比色法測定三黃糖敏湯中總多糖含量

靳淑敏，周 娜，董振詠，白 莉＊，韓 茹，耿文婧

（1.河北省石家莊市第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北 石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫(yī)院中醫(yī)科，河北 石家莊050011）

三黃糖敏湯由黃芪、黃精、黃連、枸杞、知母、桑葉、麥冬、水蛭、荔枝核九味中藥組成，臨床上主要用于改善胰島素抵抗癥狀，增加胰島素敏感性，可聯(lián)合二甲雙胍治療2型糖尿病胰島素抵抗癥狀［1］。該方黃芪、黃連、黃精等均含有大量的多糖類有效成分，多糖具有降血糖、降血脂、抗血栓、抗?jié)?、抗肝炎、抗腫瘤、延緩衰老、免疫調(diào)節(jié)等功能［2-5］。已報(bào)道的多糖含量測定方法有苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、高效液相色譜法、氣相色譜法［6-9］等，其中苯酚-硫酸比色法常用于總多糖的測定。目前，三黃糖敏湯中總多糖的含量測定方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立苯酚-硫酸比色法測定三黃糖敏湯中總多糖含量的方法，旨在為該制劑的有效質(zhì)量控制和藥理作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)；BP211D型分析天平；離心機(jī)；恒溫水浴。葡萄糖對(duì)照品（分析純，天津市百世化工有限公司，批號(hào)20101116），濃硫酸、苯酚、無水乙醇均為分析純。

1.2 三黃糖敏湯的制備 分別稱取枸杞2.0g，荔枝核1.8g，黃連1.2g，麥冬2.0g，黃芪3.0g，黃精3.0g，知母1.2g，桑葉2.0g，共16.2g，加10倍量水，浸泡30min，煎煮60min，趁熱用紗布濾過；殘?jiān)?倍量水，煎煮60min，趁熱用紗布濾過；合并2次煎煮液，濃縮至100mL，即得。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 取105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品0.1g，精密稱定，置100mL量瓶中，加水制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液10.0mL置100mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（每1mL中含無水葡萄糖0.1 mg）。

1.3.2 供試品溶液的制備 取三黃糖敏湯1.5 mL，離心（14 000r／min）10min，離心2次。取上清液1.0mL，加無水乙醇9.0mL，使醇含量為90%，4℃靜置24h，離心（10 000r／min）10min，棄去上清液，殘?jiān)鼡]干乙醇，用適量水溶解，并定容至100 mL，搖勻，過濾，即得。

1.3.3 6%苯酚溶液的制備 稱取苯酚6g，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4 顯色條件的確定

1.4.1 測定波長的確定 精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL，置15mL試管中，精密加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0mL，搖勻，置40℃水浴中反應(yīng)30min取出，冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在400～760nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長。

1.4.2 硫酸用量的考察 精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL 4份，分別置15mL試管中，各精密加入6%苯酚溶液1.4mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸3.0、4.0、5.0、6.0mL，搖勻，置40℃水浴中反應(yīng)30min取出，冷卻至室溫，分別補(bǔ)水至8.0mL，冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在確定的最大吸收波長處測定吸光度，確定硫酸的最佳用量。

1.4.3 苯酚用量的考察 精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL 5份，分別置15mL試管中，各精密加入6%苯酚溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，搖勻，分別加水補(bǔ)至2.0mL，迅速精密加入濃硫酸5.0mL，搖勻，置40℃水浴中反應(yīng)30min取出，冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在確定的最大吸收波長處測定吸光度，確定苯酚的最佳用量。

1.4.4 水浴時(shí)間的考察 精密量取對(duì)照品溶液0.6 mL 5份，分別置15mL試管中，各精密加入6%苯酚溶液1.2mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0mL，搖勻，置40℃水浴中分別反應(yīng)15、20、25、30、35min取出，冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在確定的最大吸收波長處測定吸光度，確定最佳水浴時(shí)間。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL 分別置15mL 試管中，分別加水0.4、0.3、0.2、0.1、0.0mL，各精密加入6%苯酚1.2mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，置40℃水浴中反應(yīng)25min取出，冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在490nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，采用偏最小二乘法在Excel中進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 精密度試驗(yàn) 精密量取0.6mL對(duì)照品溶液，分別置15mL試管中，按“1.5.1”中的方法，測定吸光度，連續(xù)測定6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取0.6mL供試品溶液，分別置15mL試管中，按“1.5.1”中的方法操作，于室溫下分別放置10、20、30、40、50、60min，依法測定吸光度，計(jì)算RSD。

1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取0.6mL供試品溶液6份，分別置15mL試管中，按“1.5.1”中的方法，測定吸光度，計(jì)算含量測定結(jié)果的RSD。

1.5.5 加樣回收試驗(yàn) 精密量取0.4mL已知含量的供試品溶液6份，分別置15mL試管中，精密加入0.2mL對(duì)照品溶液，按“1.5.1”中的方法測定吸光度，計(jì)算回收率。

1.5.6 樣品測定 精密量取0.6mL供試品溶液3份，按“1.5.1”中的方法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中總多糖（按葡萄糖計(jì)）含量。

2 結(jié) 果

2.1 顯色條件的確定 結(jié)果表明，對(duì)照品溶液在490nm處有最大吸收，故確定490nm為測定波長。濃硫酸由3.0mL增至6.0mL，吸光度值在5.0mL達(dá)到最大值，故確定硫酸用量為5.0mL。苯酚由0.6mL增至1.4mL，吸光度值在1.2mL達(dá)到最大，故確定6%苯酚的用量為1.2mL。水浴時(shí)間在35min之內(nèi)，吸光度值在25min時(shí)最大，故確定水浴時(shí)間為25min。因此，最終確定的最佳顯色條件為6%苯酚1.2mL，濃硫酸5.0mL，40℃反應(yīng)25 min，最佳測定波長為490nm。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證 回歸方程為A＝0.0769C-0.0288（r＝0.999 3），表明葡萄糖濃度在2.95～8.85mg／L范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。精密度試驗(yàn)測定結(jié)果的RSD為0.7%（n＝6），表明該儀器精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果的RSD為0.8%，表明供試品溶液至少在1h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果的RSD為3.4%（n＝6），表明該法重復(fù)性良好。供試品溶液的平均回收率為98.1%，RSD為2.7%（n＝6），符合含量測定要求，表明該方法準(zhǔn)確可靠。見表1。

表1 供試品加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.3 樣品測定 樣品中總多糖含量（以葡萄糖計(jì)）均值為5.9g／L，RSD為2.9%（n＝3），見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討 論

近年來對(duì)多糖提取工藝的研究方法很多，如水提醇沉法、酸提取法、堿提取法、酶提取法［10］、超聲提取法［11］、半仿生提取法［12］等。多糖是由單糖基通過糖苷鍵連接而成的化合物，在稀酸、稀堿條件下易使多糖發(fā)生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發(fā)生水解而使多糖的提取率減少，而且服用中藥一般是用熱水煎煮，因此本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取多糖［13］。

水提醇沉法利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，常采用高濃度乙醇沉淀提純多糖。由于不同性質(zhì)或不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同，本實(shí)驗(yàn)對(duì)75%、80%、85%、90%不同乙醇濃度進(jìn)行了比較，確定最佳乙醇濃度為90%。

苯酚-硫酸比色法測定多糖的原理是多糖被濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫迅速水解產(chǎn)生單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，再與苯酚生成橙色衍生物，在適當(dāng)波長下和一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系，從而可比色測定其含量［14］。該方法通過多糖水解而后定量反應(yīng)生成有色化合物，從而間接測定多糖的含量，涉及水解和呈色反應(yīng)，所受影響因素較多，因此合適的測定條件為本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。故本實(shí)驗(yàn)針對(duì)影響反應(yīng)的關(guān)鍵因素——試劑用量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了考察，苯酚-硫酸比色法測定多糖含量，為防止試劑與空白的污染，操作時(shí)應(yīng)注意避免在試管壁同一位置加入不同種試劑；另外，為保證測定結(jié)果的重復(fù)性，測定時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制混勻時(shí)間、水浴時(shí)間和水浴溫度。

通過線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率試驗(yàn)等方法學(xué)考察及樣品含量測定，表明所建立的苯酚-硫酸比色法測定三黃糖敏湯中總多糖含量簡便準(zhǔn)確、實(shí)際應(yīng)用性良好，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

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