社交挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠探索和絕望行為的影響

牛晨旭，丁 杰，郝 瀚，杜雨薇，張海林

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 石家莊050017）

抑郁癥是以顯著而持續(xù)的情緒低落為主要臨床特征的一種精神異質(zhì)性綜合征［1］。其主要臨床癥狀為：患者的情緒低落與其處境不相稱、興趣缺失、悲觀絕望、有自殺企圖或行為等。目前抑郁癥的發(fā)生機(jī)制尚未完全被闡明，也無(wú)十分理想的治療藥物。社交挫敗應(yīng)激（social defeat stress）復(fù)制的小鼠抑郁模型已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可，并已成為研究抑郁機(jī)制和抗抑郁藥物治療機(jī)制的常用模型［2-4］。已公認(rèn)社交挫敗應(yīng)激可使小鼠出現(xiàn)社交障礙和快感缺失的行為表現(xiàn)［2-4］。然而，社交挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠探索和絕望行為的影響目前尚不十分清楚。已知社交測(cè)試（social interaction test）可檢測(cè)出嚙齒類動(dòng)物是否有社交障礙行為表現(xiàn)；高架十字迷宮測(cè)試（elevated plus maze test）是檢測(cè)探索行為的方法；懸尾測(cè)試（tail-suspension test）和強(qiáng)迫游泳測(cè)試（forced swim test）是檢測(cè)絕望行為的方法［5］。因此，本研究用社交測(cè)試篩選社交挫敗應(yīng)激敏感表型（抑郁）小鼠，通過(guò)高架十字迷宮、懸尾和強(qiáng)迫游泳測(cè)試評(píng)估抑郁小鼠探索和絕望行為表現(xiàn)，以觀察社交挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠探索和絕望行為的影響，為評(píng)價(jià)該抑郁模型的應(yīng)用價(jià)值提供行為學(xué)實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性CD-1小鼠（4～6個(gè)月齡退役種鼠）和健康雄性C57BL／6J小鼠（簡(jiǎn)稱“C57小鼠”）（7～9周）均由北京維通利華公司提供。社交挫敗、高架十字迷宮動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤分析系統(tǒng)及小鼠懸尾裝置均購(gòu)于上海移數(shù)信息科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及社交挫敗敏感小鼠的篩選 將73只雄性CD-1小鼠和214只C57小鼠編號(hào)，并隨機(jī)將C57小鼠分為3部分：①45只小鼠用于篩選攻擊性的CD-1小鼠；②145只小鼠用于接受社交挫敗應(yīng)激刺激，以復(fù)制抑郁模型小鼠；③24只小鼠用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)（即對(duì)照組）。單籠飼養(yǎng)CD-1小鼠；分籠飼養(yǎng)C57小鼠，每籠2～3只。飼養(yǎng)條件為：室溫20～25℃，相對(duì)濕度為50%～70%，光暗周期為12 h。保持安靜，自由進(jìn)食進(jìn)水。應(yīng)激時(shí)間為16：00～18：30，行為學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)間為14：00～18：00。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Figure 1 Schematic of the experiment

1.2.1 攻擊性CD-1小鼠的篩選 單籠飼養(yǎng)CD-1小鼠7d，使其具有領(lǐng)地意識(shí)。然后，將用于篩選攻擊性CD-1小鼠的C57小鼠放入CD-1小鼠籠內(nèi)。3 min取出C57小鼠。用不同的C57小鼠連續(xù)篩選，每天3次，連續(xù)3d。攻擊性CD-1小鼠需滿足下列條件：①在3min篩選過(guò)程中，首次出現(xiàn)攻擊行為的時(shí)間需＜1min；②整個(gè)篩選過(guò)程中至少發(fā)生5次攻擊行為；③每次攻擊行為的持續(xù)時(shí)間不＜5s。將攻擊性CD-1小鼠用于社交挫敗應(yīng)激刺激實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 社交挫敗應(yīng)激刺激 依文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行［2］。每天模型組C57小鼠接受攻擊性CD-1小鼠攻擊10min，其余時(shí)間接受心理應(yīng)激。刺激持續(xù)10 d。10d之中，避免相同編號(hào)的攻擊性CD-1小鼠與C57小鼠再次接觸。剔除被咬傷的C57小鼠（皮膚傷口＞1cm）后，將剩余小鼠單籠飼養(yǎng)24h，進(jìn)行社交測(cè)試以篩選出抑郁小鼠。

1.2.3 社交測(cè)試 依文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行［2］。測(cè)試分為兩個(gè)階段，每個(gè)階段2.5min。第一階段：無(wú)CD-1小鼠；第二階段：有CD-1小鼠。實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)監(jiān)測(cè)C57小鼠進(jìn)入角落區(qū)和社交區(qū)的時(shí)間。每次行為學(xué)測(cè)試完畢，清除CD-1小鼠及C57小鼠遺留下的糞便和尿液，并用酒精擦拭儀器，減少對(duì)后續(xù)行為學(xué)測(cè)量的影響。

1.2.4 對(duì)照小鼠的處理 除用正常的C57小鼠替代攻擊性CD-1小鼠外，對(duì)照組C57小鼠的其余實(shí)驗(yàn)過(guò)程與模型小鼠完全相同。

1.2.5 抑郁小鼠的篩選 依據(jù)社交測(cè)試的社交指數(shù)，篩選社交挫敗敏感C57小鼠（抑郁小鼠）［2］。社交指數(shù)＝第二階段停留在社交區(qū)的時(shí)間／第一階段停留在社交區(qū)的時(shí)間×100。凡社交指數(shù)＜100的模型組小鼠均歸為社交挫敗敏感 （抑郁）小鼠。

1.3 高架十字迷宮測(cè)試 測(cè)試裝置分開(kāi)臂（50.8 cm×10.2cm ×13cm ）、閉 臂 （50.8cm×10.2cm×40.6cm）和中央?yún)^(qū)（10.2cm×10.2cm）三部分。距離地面72.4cm。在安靜狀態(tài)下，將大鼠置于迷宮中央，使其頭部面向其中一個(gè)開(kāi)臂，采用軟件記錄5min內(nèi)以下指標(biāo)：①進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)即進(jìn)入到任一開(kāi)臂的次數(shù)；②開(kāi)臂停留時(shí)間；③進(jìn)入閉臂次數(shù)即進(jìn)入到任一封閉臂的次數(shù)；④閉臂停留時(shí)間。計(jì)算：開(kāi)臂停留時(shí)間指數(shù)，即開(kāi)臂停留時(shí)間／（開(kāi)臂停留時(shí)間＋閉臂停留時(shí)間）×100；開(kāi)臂進(jìn)入次數(shù)指數(shù)，即進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)／（進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)＋進(jìn)入閉臂次數(shù)）×100。

1.4 懸尾測(cè)試［6］在距尾尖約1cm處用膠布把小鼠懸于高50cm的位置。小鼠被懸于高處會(huì)立刻出現(xiàn)逃生樣行為，之后轉(zhuǎn)變?yōu)楸粍?dòng)不動(dòng)。在最初的掙扎期后小鼠會(huì)適應(yīng)不動(dòng)狀態(tài)，類似于絕望和精神抑郁的狀態(tài)。測(cè)試期為6min，記錄后4min的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。當(dāng)小鼠完全不動(dòng)時(shí)才被認(rèn)為是不動(dòng)的。

1.5 強(qiáng)迫游泳測(cè)試［6］在圓形玻璃缸（直徑10 cm）中，放入約20cm高的溫水（22～24℃），在確保動(dòng)物不能逃脫且不被淹死的情況下，將動(dòng)物放入水缸中，強(qiáng)迫游泳6min。當(dāng)動(dòng)物在水中停止掙扎只做必要的輕微動(dòng)作保持頭在水面上的時(shí)候，被認(rèn)為是不動(dòng)。記錄后4min的不動(dòng)時(shí)間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抑郁小鼠的篩選結(jié)果 在145只模型C57小鼠中，剔除被咬傷和咬死的104只，其余41只小鼠用于社交測(cè)試篩選。經(jīng)過(guò)篩選，有37只模型小鼠社交指數(shù)＜100，歸為社交挫敗敏感（抑郁）小鼠。

2.2 社交挫敗應(yīng)激抑郁小鼠社交行為的變化 與對(duì)照組比較，社交挫敗敏感（抑郁）小鼠的社交指數(shù)明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 抑郁小鼠社交指數(shù)的變化Table 1 Change of social interaction index of depressive mice(±s）

表1 抑郁小鼠社交指數(shù)的變化Table 1 Change of social interaction index of depressive mice(±s）

?

2.3 抑郁小鼠探索行為的變化 高架十字迷宮測(cè)試中的進(jìn)入開(kāi)臂時(shí)間和進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)是檢驗(yàn)動(dòng)物探索能力的指標(biāo)。測(cè)試結(jié)果顯示，抑郁組小鼠進(jìn)入開(kāi)臂的時(shí)間和進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 抑郁小鼠探索行為的變化Table 2 Change of exploratory behaviors of depressive mice（±s）

表2 抑郁小鼠探索行為的變化Table 2 Change of exploratory behaviors of depressive mice（±s）

?

2.4 抑郁小鼠絕望行為的變化 懸尾測(cè)試和強(qiáng)迫游泳測(cè)試的動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間是檢驗(yàn)絕望行為的指標(biāo)。測(cè)試結(jié)果顯示，抑郁組小鼠懸尾測(cè)試不動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)迫游泳測(cè)試不動(dòng)時(shí)間與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 抑郁小鼠絕望行為的變化Table 3 Change of despair behaviors of depressive mice（±s，s）

表3 抑郁小鼠絕望行為的變化Table 3 Change of despair behaviors of depressive mice（±s，s）

?

3 討 論

臨床上，抑郁癥的診斷主要以癥狀為主。因此，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo)在評(píng)價(jià)抑郁癥動(dòng)物模型以及抗抑郁藥物效果方面起重要作用。社交測(cè)試是依據(jù)小鼠喜群居的社會(huì)特性設(shè)計(jì)的。位于測(cè)試場(chǎng)地的小鼠，若社交行為正常，則在第二階段停留在社交區(qū)的時(shí)間大于第一階段停留在社交區(qū)的時(shí)間，即社交指數(shù)＞100。有社交回避行為的小鼠，社交指數(shù)明顯減小。用社交指數(shù)＜100篩選社會(huì)挫敗應(yīng)激敏感型（抑郁）小鼠已得到公認(rèn)［2-4］。本研究用上述標(biāo)準(zhǔn)篩選出的社會(huì)挫敗應(yīng)激敏感型（抑郁）小鼠，其社交指數(shù)明顯小于對(duì)照組小鼠。此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2-4］。這提示，本研究篩選的抑郁小鼠有社交回避行為表現(xiàn)，抑郁模型復(fù)制成功。

高架十字迷宮測(cè)試是檢測(cè)動(dòng)物探索行為的指標(biāo)。主要依據(jù)小鼠的嗜暗特性和對(duì)新異環(huán)境探究行為設(shè)計(jì)的。在高架十字迷宮中的小鼠，若好奇心和探究性強(qiáng)，進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)就多，在開(kāi)臂內(nèi)停留的時(shí)間也長(zhǎng)；反之則由于嗜暗特性會(huì)傾向于在閉臂中停留。有文獻(xiàn)報(bào)道，社會(huì)挫敗應(yīng)激可引起青春期小鼠出現(xiàn)探索欲望降低的行為表現(xiàn)［7］。對(duì)于社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)成年小鼠探索行為的影響尚不清楚。本研究用此項(xiàng)測(cè)試檢測(cè)成年社交挫敗應(yīng)激敏感型（抑郁）小鼠，未發(fā)現(xiàn)有探索欲望降低的行為表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，社交挫敗應(yīng)激敏感型（抑郁）小鼠的探索行為可不出現(xiàn)變化；社會(huì)挫敗應(yīng)激復(fù)制的抑郁成年小鼠不適合用于研究探索欲望降低行為的發(fā)生機(jī)制及治療機(jī)制。

懸尾測(cè)試和強(qiáng)迫游泳測(cè)試均用于檢測(cè)動(dòng)物是否容易出現(xiàn)“絕望”行為［8-10］。在懸尾測(cè)試過(guò)程中，由于小鼠被懸于一定高度的位置，小鼠會(huì)先掙扎，之后轉(zhuǎn)變?yōu)椴粍?dòng)，類似于人類絕望和精神抑郁的狀態(tài)。因此，小鼠不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)則表示該小鼠易于“絕望”。小鼠在強(qiáng)迫游泳測(cè)試過(guò)程中，最初小鼠會(huì)表現(xiàn)為在水中游動(dòng)、劇烈掙扎，并試圖逃脫。當(dāng)感到逃脫不可能后，便不再掙扎和游泳，將頭部露出水面，而肢體漂浮，保持一種不動(dòng)的狀態(tài)，此狀態(tài)稱為“行為絕望”。因此，小鼠不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)則表示該小鼠易于“絕望”。有文獻(xiàn)報(bào)道，社會(huì)挫敗應(yīng)激可引起青春期小鼠強(qiáng)迫游泳測(cè)試的不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)［7］。對(duì)于社會(huì)挫敗應(yīng)激對(duì)成年小鼠“絕望”行為的影響尚不清楚。本研究上述兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均顯示，與對(duì)照組小鼠比，抑郁組小鼠可不出現(xiàn)明顯的易于“絕望”的行為表現(xiàn)。這提示，社會(huì)挫敗應(yīng)激復(fù)制的成年的抑郁小鼠不適用于研究“絕望”行為的發(fā)生機(jī)制及藥物治療機(jī)制。

綜上所述，社交挫敗應(yīng)激對(duì)不同抑郁行為影響不同；引起社交障礙的社交挫敗應(yīng)激對(duì)小鼠的探索和絕望行為無(wú)明顯影響。

［1］ Nestler EJ，Barrot M，DiLeone RJ，et al.Neurobiology of depression［J］.Neuron，2002，34（1）：13-25.

［2］ Chaudhury D，Walsh JJ，F(xiàn)riedman AK，et al.Rapid regulation of depression-related behaviours by control of midbrain dopamine neurons［J］.Nature，2013，493（7433）：532-536.

［3］ Lehmann ML，Brachman RA，Martinowich K，et al.Glucocorticoids orchestrate divergent effects on mood through adult neurogenesis［J］.J Neurosci，2013，33（7）：2961-2972.

［4］ 吳曉，吳金峰，董競(jìng)成.社交應(yīng)激動(dòng)物模型的建立及其效果評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33（6）：800-804.

［5］ 牛晨旭，郝瀚，張海林.嚙齒類動(dòng)物抑郁癥模型的行為學(xué)檢測(cè)方法［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（3）：370-372.

［6］ Jacob W，Yassouridis A，Marsicano G，et al.Endocannabinoids render exploratory behaviour largely independent of the test aversiveness：role of glutamatergic transmission［J］.Genes Brain Behav，2009，8（7）：685-698.

［7］ I?iguez SD，Riggs LM，Nieto SJ，et al.Social defeat stress induces a depression-like phenotype in adolescent male c57BL／6mice［J］.Stress，2014，17（3）：247-255.

［8］ Steru L，Chermat R，Thierry B，et al.The tail suspension test：a new method for screening antidepressants in mice［J］.Psychopharmacology（Berl），1985，85（3）：367-370.

［9］ Porsolt RD，Le Pichon M，Jalfre M.Depression：a new animal model sensitive to antidepressant treatments［J］.Nature，1977，266（5604）：730-732.

［10］ Cryan JF，Markou A，Lucki I.Assessing antidepressant activity in rodents：recent developments and future needs［J］.Trends Pharmacol Sci，2002，23（5）：238-245.