尹 翔,費海航
(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 醫(yī)療設備處,江蘇 蘇州 215004)
基于普魯士藍納米材料的靶向診療一體化的研究
尹翔,費海航
(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 醫(yī)療設備處,江蘇 蘇州 215004)
摘要:近年來,利用納米材料的光熱效應治療腫瘤成為了醫(yī)學研究的熱點。本文制備了PBMNPs,并對其紅外光譜、順磁性、近紅外光熱效應和近紅外光熱穩(wěn)定性進行了研究,分析了其細胞毒性和腫瘤磁靶向光熱治療中的效果。
關鍵詞:普魯士藍;光熱治療;磁靶向性
近年來,診療一體化的新型納米藥物研究成為癌癥治療的熱點。納米載藥體系不僅可以利用EPR效應實現(xiàn)被動靶向,還能對靶向分子進行修飾實現(xiàn)主動靶向,提高腫瘤組織附近納米藥物的富集度。
普魯士藍是一種染料,它的價格十分便宜,并且制備簡單,是一種醫(yī)院常規(guī)儲備的臨床用藥。經(jīng)過長期臨床實踐證明,它在人體內(nèi)的可靠性和安全性很高。由于普魯士藍具有良好的電化學可逆性,能使電子傳遞加速,所以,在免疫傳感器的制備中的應用前景十分廣泛。在生物傳感器中,以Fe304磁性納米粒子為核心制備出的PBMNPs(普魯士藍磁性納米粒子)應用也十分廣泛,這拓寬了普魯士藍在生物傳感器領域的應用范圍。在醫(yī)學診療一體化中應用基于普魯士藍的納米材料,將能解決多數(shù)納米材料生物安全性低且價格昂貴的難題。
1材料與方法
1.1試劑與儀器
試劑:氯化鐵(北京市第十七中學化工廠);氯化亞鐵(阿拉丁公司);過氧化氫(天津市科密歐化學試劑有限公司);鐵氰化鉀(國藥集團化學試劑有限公司);胎牛血清(FBS,背景元亨圣馬生物技術研究所);鈣黃綠素(分析純美國西格瑪試)。所有試驗用水均為去離子水。
儀器:傅里葉變換紅外光譜儀Excalibur(美國瓦里安公司);熒光倒置顯微鏡 Olympus IX(日本奧林巴斯公司);808 nm激光器T808D2W(西安銘輝光電科技公司);真空干燥機DZF-6020(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);振動樣品磁強計LH-3(南京南大儀器有限公司)。
1.2試驗方法
1.2.1磁性四氧化三鐵(Fe3O4MNPs)的制備
Fe3O4MNPs的制備方法很多,最常用的化學合成方法為共沉淀法,這可能是最簡單、高效的磁性納米顆粒合成方法。Fe3O4MNPs的制備如下:2M FeCl2·4H2O 5 mL,1M FeCl3·6H2O 25 mL和2M HCl相混合,溶液混合后,氮氣除氧l0 min。在N2條件下,將混合的鐵鹽溶液逐滴加入到250 mL、0.7M無氧氨水中,室溫劇烈攪拌30 min。磁鐵分離,用超純水洗至中性,定容至250 mL,密封保存。取出部分膠體溶液,進行磁性分離,清洗。將分離產(chǎn)物置于真空干燥箱內(nèi)烘干,得到粉末狀Fe3O4MNPs。
1.2.2磁性普魯士藍納米離子(PBMNPs)的制備
將40 mL 0.04M FeCl3·6H2O與20 μL 30% H2O2混合得到溶液A;將40 mL 0.04M K3Fe(CN)6與20 μL 30%的H2O2混合得到溶液B,在攪拌狀態(tài)下,溶液A緩慢滴加到溶液B中,再加入20 mL Fe3O4MNPs儲備液,攪拌3 h,得到磁性普魯士藍納米粒子。取出部分膠體溶液,進行磁性分離、清洗。將分離產(chǎn)物置于真空干燥箱內(nèi)烘干,得到粉末狀PBMNPs。
1.2.3紅外光譜分析
試驗采用FT-IR(傅里葉變換紅外光譜)對制備的Fe3O4MNPs和PBMNPs進行紅外光譜分析。
1.2.4Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征
采用振動樣品磁強計對Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征進行研究。
1.2.5PBMNPs的近紅外光熱效應
為了研究PBMNPs的近紅外光熱效應,試驗采用激光器分別照射5 mL普魯士藍(100 ppm)、Fe3O4(100 ppm)、PBMNPs(100 ppm)水懸液,照射波長為808 nm,研究了在激光照射過程中它們的溫度變化[1]。
1.2.6PBMNPs的近紅外光熱穩(wěn)定性
選取濃度為50 ppm PBMNPs水懸液5 mL,激光器照射10 min,照射波長為808 nm,關閉激光器,讓溶液自然冷卻到初始溫度,再次開啟激光器繼續(xù)照射10 min,如此循環(huán)照射4次,考察該納米粒子在循環(huán)中的溫度變化。
1.2.7細胞毒性試驗
將正常的靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和濃度分別為0、20、40、80、160、320、400和500 ppm的PBMNPs共同接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(5×103細胞/孔),加入0.2 mL RPMI 1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)基含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和1%鏈霉素。在含有5% CO2的37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后,每個孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT PBS溶液,并繼續(xù)培養(yǎng)3 h。隨后,移除含有MTT的培養(yǎng)基,每孔加入100 μL DMSO(二甲基亞砜),在搖床上震蕩10 min,使用酶標儀測定每孔在490 nm處的吸光度值。使用不加藥物的細胞作為100%細胞生成率對照,使用不加MTT的細胞作為空白調(diào)零對照。所有組別試驗重復3次。每組細胞生存率(%)計算公式為(A樣品-A空白/A對照-A空白)×l00%,考察了不同濃度磁性普魯士藍納米粒子的細胞毒性。
1.2.8PBMNPs對腫瘤的磁靶向光熱治療效果
RPMI 1640培養(yǎng)基加入100 ppm PBMNPs與HeLa(人宮頸癌細胞),在37 ℃孵育48 h。在培養(yǎng)過程中,將磁鐵放在培養(yǎng)皿的底部中間,通過磁場吸附磁性納米粒子30 min。然后采用波長為808 nm的激光器垂直照射6孔板底部10 min。最后細胞用PBS洗2遍,用鈣黃綠素染色,隨后用熒光顯微鏡成像。熒光顯微鏡下,活細胞為綠色,死細胞無色。試驗設置6個處理:1)無PBMNPs,無激光照射;2)無PBMNPs,激光照射;3)有PBMNPs,無激光照射;4)有PBMNPs,磁鐵吸附,無激光照射;5)有PBMNPs,無磁鐵吸附,激光照射;6)有PBMNPs,磁鐵吸附,有激光照射。每個處理三個平行,研究PBMNPs對腫瘤的磁靶向光熱治療效果。
2結果與討論
2.1Fe3O4MNPs和PBMNPs的圖片
本試驗以Fe3O4MNPs為核,在其表面包裹了一層普魯士藍納米殼,制備得到了PBMNPs。普魯士藍納米粒子的圖片如圖1所示。
圖1 Fe3O4MNPs和PBMNPs顯微圖片
由圖1可見,F(xiàn)e3O4MNPs呈球狀,大小均一,其平均粒徑約為18 nm。根據(jù)以往的文獻報道,F(xiàn)e3O4納米粒子的粒徑<20 nm時,其超順磁性良好,可以廣泛應用在磁靶向研究中。制備的PBMNPs結構和Fe3O4納米粒子結構不同,PBMNPs的外表具有一層殼狀結構。
2.2Fe3O4MNPs和PBMNPs的紅外光譜分析結果
Fe3O4MNPs和PBMNPs的紅外光譜圖如圖2所示。從Fe3O4MNPs的紅外光譜圖可以看出,604 cm-1是Fe-O的特征吸收峰,說明該物質(zhì)為Fe3O4MNPs;從PBMNPs的紅外光譜圖可以看出,604 cm-1處為Fe-O的特征吸收峰,2 084 cm-1為Fe3+-CN-Fe(II)橋式氰基伸縮振動吸收峰,說明在Fe3O4表面合成了PB納米粒子。試驗成功制備了具有核殼結構的磁性普魯士藍納米粒子。
圖2 制備的Fe3O4MNPs和PBMNPs的紅外光譜圖
2.3Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征試驗結果
Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征試驗結果如圖3所示。
圖3 Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁滯回線
圖3a和圖3b的曲線經(jīng)過原點(0,0),說明Fe3O4MNPs和PBMNPs都具有超順磁性,在一定磁場作用下能夠發(fā)生定向移動;因此,PBMNPs可用于磁靶向光熱治療的研究。
2.4磁性普魯士藍納米粒子的近紅外光熱效應
近紅外光熱劑在近紅外激光的照射下,光熱劑會吸收近紅外光并可將其吸收的近紅外光轉換為熱量。100 ppm Fe3O4納米粒子、100 ppm普魯士藍和100 ppm PBMNPs水懸液在808 nm激光照射10 min中的溫度變化結果如圖4所示。
圖4 去離子水、Fe3O4NPs、PBNPs和PBMNPs 水懸液激光照射溫度變化
由圖4可知,100 ppm的Fe3O4NPs水懸液在激光照射10 min后,其溫度大約升高了5 ℃,變化不大。試驗結果說明,F(xiàn)e3O4NPs的近紅外光熱效應很弱,這主要因為Fe3O4NPs納米粒子在近紅外光區(qū)的光吸收較弱。100 ppm的PBNPs水懸液在激光照射的10 min中,溫度迅速上升,升至58.0 ℃,升溫速度較快。說明PBNPs的近紅外光熱效應較強。100ppm的PBMNPs水懸液在激光照射的10 min中,溫度也明顯升高,照射結束時,溫度達到了48.1 ℃,充分說明制備的PBMNPs光熱效應良好,這主要是因為普魯士藍納米殼的紅外光吸收效應良好。該PBMNPs水懸液照射約7 min,溫度就可由20 ℃升至42.6 ℃,超過了光熱殺死腫瘤細胞的溫度臨界值(42 ℃)。由于Fe3O4NPs的超順磁性良好,所以,PBMNPs將來在腫瘤的磁靶向光熱治療中應用前景良好。
2.5PBMNPs的近紅外光熱穩(wěn)定性
光熱穩(wěn)定性可以用來評價光熱劑性能,光熱穩(wěn)定性越高,其在癌癥光熱治療中的應用效果越好,因此,需要對PBMNPs進一步進行光熱穩(wěn)定性研究。試驗結果如圖5所示。由于PBMNPs具備良好的近紅外光熱效應,開啟激光器后,溫度迅速上升,照射10 min后,該PBMNPs水懸液的溫度由20 ℃上升至38.9 ℃。關閉激光器后,溫度開始慢慢自然下降。當降至初始溫度20 ℃時,再次開啟激光器,水懸液的溫度又開始上升,如此循環(huán)4次。
圖5 PBMNPs(100 ppm)水懸液激光照射 循環(huán)中的溫度變化
由圖5可知,該PBMNPs水懸液在這4個循環(huán)過程中的溫度變化十分穩(wěn)定,照射10 min后,4次的溫度分別升至39.8、39.6、39.7和39.9 ℃,說明PBMNPs的光熱穩(wěn)定性良好,在多次重復使用后,光熱效果穩(wěn)定。該PBMNPs的高光熱穩(wěn)定性主要是因為普魯士藍納米殼的結構穩(wěn)定性較高[2]。
2.6細胞毒性試驗結果
PBMNPs的細胞毒性試驗結果如圖6所示。靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)與PBMNPs孵育,表現(xiàn)出與劑量相關的細胞毒性,PBMNPs濃度<500 ppm,細胞存活率均>90%,表明PBMNPs對HUVEC細胞生長沒有明顯的影響(P>0.05)。上述結果表明,該PBMNPs對HUVEC細胞的細胞毒性較小,因此具有較好的細胞相容性。因為普魯士藍是一種臨床用藥,所以,它的生物相容性較高;同時,F(xiàn)e3O4NPs在臨床中也得到了應用,因此它的生物相容性也較好。正是因為二者的生物相容性良好,導致PBMNPs也具有良好的細胞相容性。
圖6 PBMNPs的細胞毒性試驗(P<0.05)
2.7PBMNPs對腫瘤的磁靶向光熱治療效果
利用磁性納米粒子的流動性和磁性,在外加磁場的控制下,在特定的靶向部位進行富集,發(fā)揮定向優(yōu)勢。在用鈣黃綠素進行雙染后用熒光顯微鏡成像,活細胞顯示綠色,試驗結果如圖7所示。
圖7 人宮頸癌細胞(HeLa)經(jīng)不同處理后的鈣黃綠素 染色熒光顯微鏡圖片
從圖7可以看出:處理a~c中,HeLa細胞熒光全部為綠色,表明HeLa細胞全部存活。處理b中,在磁鐵吸附PBMNPs的情況下,HeLa細胞存活,說明磁鐵吸附磁性納米粒子本身不會造成腫瘤細胞死亡。處理c說明,存在PBMNPs時,無磁鐵吸附,激光照射不會造成HeLa細胞死亡。處理d中,在激光照射前,將磁鐵在6孔板底部放置30 min,再用激光照射10 min,熒光顯微鏡圖片中出現(xiàn)了一塊黑色區(qū)域,該區(qū)域和激光的照射區(qū)域相同,周圍HeLa細胞存活,激光照射區(qū)域的HeLa細胞死亡。由于納米離子具有一定的磁性,可在磁場中定向移動,因此該PBMNPs可在磁場的作用下,定位至6孔板底部,分散于生長在板底的HeLa細胞表面,提高了納米離子的作用濃度,納米粒子吸收光能轉化成熱能,提高了對腫瘤細胞的光熱切除效果。
3結語
本文研究的是基于PBMNPs的靶向診療一體化,試驗結果表明,PBMNPs能夠提高腫瘤的光熱治療效果,對其進行深入研究,可以挖掘其在腫瘤臨床治療中的巨大作用,發(fā)揮其重要價值。
參考文獻
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[2] 周鳴宇,梁小蕊,吳世永,等.試驗條件對氧化鋅納米材料形貌的影響[J]. 新技術新工藝,2013(12):111-113.
責任編輯鄭練
Research on the Diagnosis and Treatment of Targeting Prussian Blue Nano Particles
YIN Xiang, FEI Haihang
(Equipment Department, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China)
Abstract:In recent years, the treatment of tumors by using the photothermal effect of nano materials has become a focus in medical research. In the paper, PBMNPs were prepared and its infrared spectrum, paramagnetism, near-infrared photothermal effect, near-infrared photothermal stability had been researched. The photothermal effect in magnetic targeting tumor treatment and the cytotoxicity of PBMNPs were also analyzed.
Key words:Prussian blue, photothermal therapy, magnetic targeting
收稿日期:2015-01-05
作者簡介:尹翔(1981-),男,工程師,主要從事醫(yī)療設備儀器等方面的研究。
中圖分類號:R 730.54
文獻標志碼:A