基于ISSR分子標(biāo)記的褐馬雞親緣關(guān)系分析

武玉珍,馮睿芝,張 峰

1 晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，晉中 030619 2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032 3 山西大學(xué)生命科學(xué)院，太原 030006

基于ISSR分子標(biāo)記的褐馬雞親緣關(guān)系分析

武玉珍1,馮睿芝2,張 峰3,*

1 晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，晉中 030619 2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032 3 山西大學(xué)生命科學(xué)院，太原 030006

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)是中國(guó)特有瀕危鳥類，國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物。為了保護(hù)褐馬雞種質(zhì)資源，保障馴養(yǎng)繁育種群和再引入種群的遺傳基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化，采用 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)山西龐泉溝國(guó)家自然保護(hù)區(qū)和太原動(dòng)物園兩個(gè)種群35個(gè)褐馬雞進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。從20條ISSR引物中篩選出10條擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定、重復(fù)性好的引物，共擴(kuò)增出65條DNA條帶，其中 77%呈多態(tài)性。兩個(gè)種群各個(gè)體之間的Nei′s無(wú)偏差遺傳距離和遺傳相似度分析表明：個(gè)體間遺傳相似性的平均值分別為0.5061與0.7591，遺傳距離的平均值分別為0.4939與0.2409。用組平均法對(duì)35個(gè)褐馬雞個(gè)體進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示：大多數(shù)同一種群的個(gè)體首先聚在一起，顯示出生態(tài)地理?xiàng)l件相似的種群親緣關(guān)系較近。

褐馬雞；ISSR；遺傳距離；遺傳相似度；聚類分析；親緣關(guān)系

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)為中國(guó)特有珍稀鳥類，國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，世界瀕危物種。目前褐馬雞只分布在中國(guó)華北的部分地區(qū)，由于太行山和黃河的阻隔，褐馬雞的棲息地被分割成三塊孤立的自然地理區(qū)域，形成了三個(gè)獨(dú)立的褐馬雞種群，即山西呂梁山的中部種群、河北小五臺(tái)山與北京東靈山的東部種群、陜西黃龍山的西部種群。山西省是褐馬雞分布中心和多度中心。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)于褐馬雞的研究主要集中在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、資源調(diào)查及保護(hù)等方面[1- 3]，近年來(lái)以分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行褐馬雞遺傳多樣性方面的研究[4- 7]有少量報(bào)道，表明對(duì)褐馬雞的研究開始從宏觀進(jìn)入微觀分子水平。但采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)褐馬雞親緣關(guān)系的研究目前尚未見報(bào)道。ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)是Zietkiewicz等[8]于1994年創(chuàng)建的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，它是根據(jù)基因組中廣泛存在的微衛(wèi)星序列，設(shè)計(jì)通用引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而檢測(cè)基因組中微衛(wèi)星序列的變異。ISSR結(jié)合了SSR和 RAPD 的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、檢測(cè)方便，近年來(lái)廣泛應(yīng)用在種群遺傳多樣性[9- 10]、種質(zhì)資源鑒定[11- 12]、親緣關(guān)系[13- 14]和系統(tǒng)發(fā)育[15]等方面的研究。

本文采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)山西龐泉溝國(guó)家自然保護(hù)區(qū)和太原動(dòng)物園的兩個(gè)褐馬雞種群的35個(gè)個(gè)體進(jìn)行親緣關(guān)系分析, 旨在了解這兩個(gè)分別代表山西野生種群和籠養(yǎng)種群褐馬雞的遺傳背景和種質(zhì)潛質(zhì)，為保護(hù)褐馬雞種質(zhì)資源和褐馬雞的野外放歸與再引入提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料：龐泉溝褐馬雞樣品18份，其中肌肉樣品3份，采自龐泉溝保護(hù)區(qū)繁育場(chǎng)死亡幼雛；血液樣品15份，采自保護(hù)區(qū)繁育場(chǎng)混養(yǎng)的成年褐馬雞。太原動(dòng)物園血液樣品17份，均采自動(dòng)物園籠養(yǎng)種雞，實(shí)驗(yàn)樣品共35份。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

分別取 0.34g肌肉、10—70 μL的血液，采用常規(guī)的SDS/蛋白酶K裂解, 酚/氯仿法提取基因組總DNA，詳細(xì)操作參照武玉珍[16]文獻(xiàn)。

1.2.2 ISSR引物的篩選

依據(jù)加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物序列，參照Abbot[17]與白秀娟[18]的研究結(jié)果，選擇其中的20條引物(表1)，均由北京奧科公司合成。通過(guò)4個(gè)隨機(jī)樣本的選擇，從20條ISSR引物中篩選出10條擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、條帶清晰、重復(fù)性好的引物，再對(duì)全部材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

在25μL反應(yīng)體系中含有10×PCR Buffer 2.5μL、25mmol/L Mg2+2μL、1.25 mmol/L dNTP 4μL、5.0 μmol/L引物5.0μL、2 U/μL Taq酶0.5μL、10 ng—150 ng/μL DNA模板1 μL，余量由ddH2O補(bǔ)足，在PTC- 150 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，退火溫度38—54 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7min。每條引物的PCR反應(yīng)退火溫度見表1。

表1 ISSR引物序列Table 1 ISSR primer sequences

1.2.4 電泳檢測(cè)

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，DNA marker為DL2000 (購(gòu)自大連寶生物公司)，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，并記錄電泳結(jié)果。

圖1 引物ISSR 811對(duì)太原動(dòng)物園1—10號(hào)樣品擴(kuò)增的指紋圖譜Fig.1 Profile of the Brown-eared pheasant from Taiyuan Zoo by primer 811

1.2.5 譜帶分析

ISSR擴(kuò)增譜帶以 0、1數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在同一引物，同一位點(diǎn)，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有(1)無(wú)(0)得到二元資料，形成ISSR分析的原始數(shù)據(jù)矩陣(0，1)矩陣。利用PhylTools6.0軟件計(jì)算兩個(gè)種群各個(gè)體之間的Nei′s無(wú)偏差遺傳距離和遺傳相似度，應(yīng)用組平均法對(duì)褐馬雞35個(gè)個(gè)體的(0，1)原始矩陣進(jìn)行聚類分析，得到聚類結(jié)果。

2 研究結(jié)果

2.1 ISSR擴(kuò)增圖譜

本實(shí)驗(yàn)中共試驗(yàn)了20 條ISSR 引物, 其中10條可擴(kuò)增出清晰條帶, 將其用于供試35個(gè)樣本PCR擴(kuò)增，引物編號(hào)分別為806、807、808、809、811、812、815、816、817和818，除806外，引物的退火溫度在50℃以上, 保證了PCR 反應(yīng)較高的特異性。10條引物共擴(kuò)增出65條清晰穩(wěn)定的條帶，擴(kuò)增片段大小在300—2000bp之間，每個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)從5到9不等，平均為6.5，65個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)中有50個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)比率為76.9%。引物對(duì)部分樣品的擴(kuò)增結(jié)果見圖1—圖3。

圖2 引物ISSR 811擴(kuò)增的太原動(dòng)物褐馬雞11—17號(hào)樣和龐泉溝12、13樣品的指紋圖譜Fig.2 Profile of the Brown-eared pheasant from Taiyuan Zoo and Pangquangou Nature Reserve by primer 811

圖3 引物ISSR811擴(kuò)增的龐泉溝自然保護(hù)區(qū)褐馬雞樣品的指紋圖譜Fig.3 Profile of the Brown-eared Pheasant of Pangquangou Natural Reserve using primer 811

2.2 遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

利用PhylTools軟件計(jì)算出了褐馬雞兩個(gè)種群各個(gè)體之間的Nei′s遺傳距離(表2和表3)、遺傳相似系數(shù)(表4和表5)。

從表2可以看出：太原動(dòng)物園17個(gè)個(gè)體間的遺傳距離為0.0000—0.5348，平均值為0.2409。其中，dwy8與dwy6之間遺傳距離最大為0.5348，其次是dwy1與 dwy10間為0.5000，而dwy7與dwy2，dwy9與dwy5，dwy12分別與dwy5、dwy9，dwy13與dwy3，dwy14分別與dwy3、dwy13，dwy16與dwy15，dwy17與dwy4間遺傳距離為0.0000。

表2 太原動(dòng)物園17只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳距離Table 2 Nei′s Genetic distance of the 17 individuals of Brown-eared pheasant from Taiyuan Zoo

1—17 分別為：dwy 1—17 號(hào)個(gè)體

從表3可以看出：龐泉溝保護(hù)區(qū)18個(gè)個(gè)體間的遺傳距離在0.000—1.000之間，平均值為0.4939。其中，pqg2與pqg5、pqg 8、pqg14—18，pqg3與pqg5，pqg4與pqg5、pqg 8、pqg14—18，pqg5與pqg8、pqg12，pqg7與pqg11，pqg8與pqg11，pqg11與pqg16遺傳距離最遠(yuǎn)為1.0000；其次是pqg10與pqg2、pqg4以及pqg9與pqg11間遺傳距離為0.8182；而pqg4與pqg2、pqg12與pqg3、pqg15與pqg14遺傳距離最近為0.0000。

表3 龐泉溝自然保護(hù)區(qū)18只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳距離Table 3 Nei′s Genetic distance of the 18 individuals of Brown-eared pheasant from Pangquangou Nature Reserve

1—18 分別為：pqg 1—18 號(hào)個(gè)體

從表4可以看出：太原動(dòng)物園種群中，dwy7與dwy2，dwy9與dwy5，dwy12分別與dwy5、dwy9，dwy13與dwy3，dwy14分別與dwy1、dwy4，dwy16與dwy15，dwy17與dwy4之間遺傳相似度最高為1.0000，遺傳距離最近；而dwy8與dwy6之間遺傳相似度最低為0.4615，遺傳距離最遠(yuǎn)。

表4 太原動(dòng)物園17只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳相似系數(shù)Table 4 Nei′s Genetic similarities of 17 individuals of Brown-eared pheasant of Taiyuan Zoo

1—17 分別為：dwy 1—17 號(hào)個(gè)體

從表5可以看出：龐泉溝自然保護(hù)區(qū)種群中，pqg4與pqg2，pqg12與pqg3，pqg15與pqg14遺傳相似度最高為1.0000，遺傳距離最近；而pqg2、pqg4分別與pqg5、pqg8、pqg14、pqg15、pqg16、pqg17、pqg18，pqg5分別與pqg3、pqg8、 pqg12，pqg11與pqp8、pqg7，遺傳一致度最低為0.0000，遺傳距離最遠(yuǎn)。

表5 龐泉溝自然保護(hù)區(qū)18只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳相似系數(shù)Table 5 Nei′s Genetic similarities of 18 individuals of Brown-eared pheasant of Pangquangou Nature Reserve

1—18 分別為：pqg 1—18號(hào)個(gè)體

2.3 親緣關(guān)系聚類圖

應(yīng)用組平均法對(duì)褐馬雞35個(gè)個(gè)體的(0，1)原始矩陣進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。從圖4看出：35個(gè)個(gè)體聚為3類，其中24(pqg7)為單獨(dú)一類；太原動(dòng)物園除dwy7外，其它個(gè)體聚為一類；龐泉溝自然保護(hù)區(qū)的個(gè)體聚為一類。大多數(shù)同一種群的不同個(gè)體首先聚在一起，顯示出明確的生態(tài)地理?xiàng)l件相似的種群優(yōu)先相聚，也就是說(shuō)生態(tài)地理?xiàng)l件相似的種群親緣關(guān)系較近。pqg7顯示出與兩個(gè)種群的其他個(gè)體親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；dwy6與動(dòng)物園種群的其他個(gè)體親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；dwy7顯示出與龐泉溝種群具有較近的親緣關(guān)系。

圖4 用Between-groups linkage法構(gòu)建的褐馬雞兩個(gè)種群35個(gè)個(gè)體的ISSR聚類圖Fig.4 ISSR dendrogram of 35 individuals from two populations of Brown-eared pheasant using Between-groups linkage

3 分析與討論

3.1 ISSR實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性

要獲得一個(gè)物種不同種群的遺傳背景信息，必需檢測(cè)大量的樣本，檢測(cè)方法的穩(wěn)定性也是非常重要的。ISSR引物一般是由17bp的堿基組成，對(duì)基因組DNA具有快速、高效、靈敏的檢測(cè)特性，而且可重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、成本較低，實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性較高[19]。由于ISSR的穩(wěn)定性受Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度等因素的影響，因此，進(jìn)行ISSR大量樣本的擴(kuò)增前，先對(duì)ISSR反應(yīng)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用統(tǒng)一的PCR反應(yīng)條件。對(duì)20條ISSR引物進(jìn)行了篩選，其中有10條引物能擴(kuò)增出條帶清晰且具多態(tài)性的帶型。在這10條引物中(AG)n與(CA)n各有3條，(GA)n有2條，說(shuō)明褐馬雞基因組中存在大量的(CA)、(AG)二核苷酸重復(fù)序列。在引物篩選的過(guò)程中，退火溫度較高的引物擴(kuò)增效果均較退火溫度低的好，篩選出所選用的10條引物只有1條退火溫度較低，其它9條引物退火溫度均較高。在ISSR圖譜中出現(xiàn)某種群的特征條帶，引物815的擴(kuò)增圖譜只有龐泉溝種群的個(gè)體出現(xiàn)大于1000 bp 的片段，引物811、812、809對(duì)龐泉溝自然保護(hù)區(qū)種群的擴(kuò)增有特異性。引物811可以將這35個(gè)個(gè)體區(qū)分開。因此，只要引物選擇合適，擴(kuò)增出種群的特征性譜帶，有助于種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析，為進(jìn)一步克隆、測(cè)序，尋找種群特有的分子標(biāo)記提供了可能。

應(yīng)用mtDNA標(biāo)記和ISSR標(biāo)記兩種方法，對(duì)這兩個(gè)褐馬雞種群進(jìn)行了遺傳多樣性的研究[5,7]，二者的結(jié)果基本一致，這表明無(wú)論用線粒體DNA標(biāo)記(mtDNA)，還是細(xì)胞核DNA標(biāo)記(ISSR)，研究的結(jié)果基本相同，可以互為印證。這說(shuō)明ISSR標(biāo)記是一種研究種群遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、種質(zhì)資源及親緣關(guān)系的穩(wěn)定有效工具。

3.2 親緣關(guān)系分析

山西龐泉溝國(guó)家自然保護(hù)區(qū)與太原動(dòng)物園兩個(gè)褐馬雞種群個(gè)體間遺傳相似性的平均值分別為0.5061與0.7591，遺傳距離的平均值分別為：0.4939與0.2409，35只褐馬雞個(gè)體總的Nei′s遺傳距離和相似性系數(shù)平均值分別為：0.3723和0.6310。分析表明兩個(gè)種群的遺傳變異有差異，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平，兩個(gè)種群個(gè)體之間親緣關(guān)系較近。聚類分析結(jié)果表明：遺傳距離較近的個(gè)體聚在一起，然后與遺傳距離較遠(yuǎn)的個(gè)體再聚。遺傳距離較近的個(gè)體親緣關(guān)系近，而遺傳距離較遠(yuǎn)的個(gè)體，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。大多數(shù)同一種群的不同個(gè)體首先聚在一起，顯示出生態(tài)地理?xiàng)l件相似的種群優(yōu)先相聚，但也存在不同種群聚在一起的情況。如圖4中pqg7單獨(dú)聚為一類，顯示出與兩個(gè)種群親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)可能是來(lái)自保護(hù)區(qū)分布較遠(yuǎn)的不同種群的后代。圖4中dwy7與龐泉溝種群聚為一類，顯示出與龐泉溝種群有較近的親緣關(guān)系，推測(cè)這兩個(gè)褐馬雞種群可能具有共同的親源。這一結(jié)論與太原動(dòng)物園飼養(yǎng)褐馬雞的歷史相符合。太原動(dòng)物園1959年由蘆芽山(寧武縣)提供褐馬雞種源，開始試驗(yàn)人工飼養(yǎng)，曾經(jīng)4次較大數(shù)量補(bǔ)充野生種源，1979—1983年從蘆芽山補(bǔ)充60余只，1992年和2014年分別從龐泉溝自然保護(hù)區(qū)補(bǔ)充野生種源8只、6只，2011年從蘆芽山補(bǔ)充野生卵孵化9只。到2000年建成了全國(guó)最大的褐馬雞人工飼養(yǎng)繁育基地，為全國(guó)各地動(dòng)物園提供褐馬雞種源和觀賞雞。

兩個(gè)種群遺傳相似性和遺傳距離的差異(表2—表5)，反應(yīng)出兩個(gè)種群飼養(yǎng)方式的不同。龐泉溝自然保護(hù)區(qū)的個(gè)體間遺傳相似性的平均值低于太原動(dòng)物園，遺傳距離的平均值高于太原動(dòng)物園，說(shuō)明龐泉溝種群個(gè)體間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，動(dòng)物園種群個(gè)體之間的親緣關(guān)系較近。這種狀況與兩個(gè)種群不同的飼養(yǎng)方式有關(guān)。龐泉溝自然保護(hù)區(qū)繁育場(chǎng)采取仿野生的散養(yǎng)、混養(yǎng)方式，并且每年從保護(hù)區(qū)野外撿拾褐馬雞卵進(jìn)行孵化補(bǔ)充種群，繁育場(chǎng)的種群雖然有可能近親繁殖，但因?yàn)椴粩嘤行路N源補(bǔ)充，群體的親緣關(guān)系仍較遠(yuǎn)。太原動(dòng)物園從1996年起選配12對(duì)成年褐馬雞實(shí)行“一夫一妻”的分籠配對(duì)繁殖飼養(yǎng)，這種方式有效避免了近交繁殖，但是種源有限，更新也較慢，群體的親緣關(guān)系仍比較近。因?yàn)轱曫B(yǎng)的用途不同，所采取的飼養(yǎng)方式也不同。

本試驗(yàn)對(duì)褐馬雞兩個(gè)種群35個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳距離聚類及親緣關(guān)系分析，可作為優(yōu)質(zhì)種源和再引入親本選擇時(shí)的理論依據(jù)。作為親本應(yīng)盡量選擇遺傳距離大于0.5的組合，同時(shí)避免遺傳距離小于 0.25的親本組合?？芍攸c(diǎn)選擇龐泉溝自然保護(hù)區(qū)野生種群的pqg2、pqg4分別與pqg5、pqg8、pqg14、pqg15、pqg16、pqg17、pqg18，pqg5與pqg3、pqg8、 pqg12，pqg11與pqp7、pqg8等，這些個(gè)體之間遺傳相似性最低(0.0000)，遺傳距離最遠(yuǎn)(1.0000)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，可以作為優(yōu)質(zhì)親本種源。

3.3 ISSR標(biāo)記在野生動(dòng)物研究中的應(yīng)用前景

ISSR標(biāo)記常用作一種植物(農(nóng)作物、藥材等)多個(gè)品種、品系之間親緣關(guān)系的區(qū)分和鑒定。但野生動(dòng)物個(gè)體之間外部形態(tài)差異不大，親緣關(guān)系主要與生態(tài)地理環(huán)境有關(guān)，特別是像褐馬雞這種飛行能力較差的地棲鳥類。應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)可以有效分辨動(dòng)物個(gè)體之間的親緣關(guān)系，同時(shí)可以篩選出親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的個(gè)體，如獨(dú)自聚為一類的pqg7個(gè)體(圖4)，作為人工飼養(yǎng)繁育的優(yōu)質(zhì)種源和褐馬雞再引入的原始種源。棲息地的破碎化致使我國(guó)的褐馬雞被分割為3個(gè)孤立種群(山西、河北、陜西)，各種群之間因地理阻隔難有基因交流，遺傳多樣性較低[5,7]。以ISSR標(biāo)記研究褐馬雞親緣關(guān)系、尋找發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種源，對(duì)褐馬雞的種群發(fā)展和科學(xué)保護(hù)具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

ISSR標(biāo)記作為以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，除具有操作簡(jiǎn)單、成本低、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)外，還有所需 DNA模板量少、穩(wěn)定和多態(tài)條帶豐富等優(yōu)點(diǎn)，是研究物種遺傳背景的有效工具。ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、植物分類、進(jìn)化和遺傳多樣性等研究[20]，而在動(dòng)物研究中應(yīng)用較少[21]，僅有少數(shù)家禽與水產(chǎn)魚蝦蟹的研究。ISSR標(biāo)記用于瀕危野生動(dòng)物的研究則更少，僅見東北虎[18](Pantheratigrisaltaica)、金錢豹[22](Pantherapardus)和北海獅[23](Eumetopiasjubatus)、獐(Hydropotesinermis)[24]等研究，而用于珍稀野生鳥類的研究鮮見報(bào)道。本研究將ISSR標(biāo)記技術(shù)用于中國(guó)特有的瀕危鳥類——褐馬雞的親緣關(guān)系研究，擴(kuò)展了鳥類遺傳背景和系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究手段，是有意義的嘗試和探索，對(duì)其他野生動(dòng)物的遺傳分析也不失為一種便捷穩(wěn)定的方法。由于采樣數(shù)量及引物數(shù)量較少，檢測(cè)到的位點(diǎn)有限，對(duì)褐馬雞圈養(yǎng)和野生種群親緣關(guān)系的全面評(píng)價(jià)，有待于進(jìn)一步深入研究。

致謝：山西省自然保護(hù)區(qū)管理站張龍勝教授、山西龐泉溝國(guó)家自然保護(hù)區(qū)管理站武建勇高級(jí)工程師及太原動(dòng)物園衛(wèi)澤珍副主任、孟慶珍獸醫(yī)師等對(duì)樣品采集中給予幫助，特此致謝。

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Analysis on genetic relationship of Brown-eared pheasant (Crossoptilonmantchuricum) based on ISSR molecular marker

WU Yuzhen1, FENG Ruizhi2, ZHANG Feng3,*

1SchoolofBiologyScienceandTechnology,JinzhongUniversity,Jinzhong030619,China2InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China3SchoolofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

The Brown-eared pheasant (Corossoptilonmantchuricum) is a critically endangered endemic to China, listed in the national first-class protected bird in China. At present, the distribution area of the Brown-eared pheasant was isolated by Yellow River and Taihang Mountains to form the three regions and the three isolated populations. Those isolated geographic populations are the middle population located in Lvliang Mountains, Shanxi; the east population in Dongling Mountains, Beijing and Xiaowutai Mountains, Hebei and the west population in Huanglong Mountains, Shaanxi, among which Shanxi is the distribution center and abundance center of the Brown-eared pheasant. So far the most researches concerning the Brown-eared pheasant mainly focus on biological, ecological, resource investigation and protection. Using molecular biological method to the research of genetic diversity of the Brown-eared pheasant is still at the initial stage. For the protection of germplasm resources of the Brown-eared pheasant and to optimize the genetic structure of captive populations and further reintroduction, we detected the genetic relationship of 35 individuals in two populations in Shanxi from Pangquangou Nature Reserve and Taiyuan Zoo were studied by using ISSR markers. Ten pairs of primers with repeatable clear and stable bands from 20 pairs of ISSR primers for 35 samples of the two populations were selected, and 65 DNA bands were amplified with polymerase chain reactions, 77% of which were polymorphic bands. PhylTools software was used to calculate Nei′s genetic distance and genetic similarity of each individual from the two populations. The analysis from Nei′s genetic distance and genetic similarity of individuals from each other showed that the means of genetic similarity of individuals from the two populations were 0.5061 and 0.7591, and the means of Nei′s genetic distance were 0.4939 and 0.2409, respectively. As a whole, the means of Nei′s genetic distance and genetic similarity of all 35 individuals are 0.3723 and 0.6310, respectively, which indicated that the genetic variation of individuals in the two populations were at low level, with relatively close genetic distance. We also performed cluster analysis using group average clustering method with (0, 1) matrix and Nei′s genetic distance of the 35 individuals. The results showed that the samples with close genetic distance had close genetic relationship. Most individuals from the same population were grouped together; it indicated that those from similar ecological and geographical environment had the closer relationship. The individuals from Pangquangou Nature Reserve had lower genetic similarity and further genetic distance with each other than the individuals from Taiyuan Zoo, which indicated that those from Pangquangou Nature Reserve had further genetic relationship than those from Taiyuan Zoo. This may due to the free-ranging method and the annual supplement of picking up wild eggs and hatching in Pangquangou Nature Reserve. With this approach, we can easily identify genetic relationship of individuals and select those with relatively far genetic distance for high quality germplasm resource. This method would serve as a novel tool in the research of endangered birds.

Crossoptilonmantchuricum; ISSSR; genetic distances; genetic similarity; cluster analysis; genetic relationship

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)(2011FY110300); 山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012011034- 3); 山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(20100012)和山西省教改資助項(xiàng)目(J2011088)

2014- 08- 05;

2014- 12- 10

10.5846/stxb201408051563

*通訊作者Corresponding author.E-mail: fzhang@sxu.edu.cn

武玉珍,馮睿芝,張峰.基于ISSR分子標(biāo)記的褐馬雞親緣關(guān)系分析.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(4):1059- 1067.

Wu Y Z, Feng R Z, Zhang F.Analysis on genetic relationship of Brown-eared pheasant (Crossoptilonmantchuricum) based on ISSR molecular marker.Acta Ecologica Sinica,2015,35(4):1059- 1067.