miRNA－126－3p與先天性心臟病肺動脈高壓發(fā)病機(jī)制相關(guān)性的臨床研究

成 力，李小慶，陳文江，陳 燦

（1．廣東醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣東湛江524023；2．第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶400037；3．廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江524001）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種臨床越來越常見的病理生理綜合征，主要累及肺小動脈，并使肺血管阻力增加，血管病變，是繼冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓之后的第3個常見的心血管疾病，其特征性病理改變主要是中膜肥厚、內(nèi)膜增殖和閉塞、血栓形成、血管肌化、血管收縮、外膜增厚、血管及周圍炎癥細(xì)胞浸潤等。其病因復(fù)雜，可由單一或多種心臟、肺部或肺血管疾病引起，其臨床特征為右心室后負(fù)荷增加，嚴(yán)重者可因右心衰竭而死亡。其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、藥物毒性、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血栓形成等有關(guān)，但還有待進(jìn)一步研究［1］。最近研究證實一部分微小RNA（microRNA，miRNA）可能與PH 發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如 miRNA－1、miRNA－21、miRNA－34、miRNA－133、miRNA－204、miRNA－208 等［2－5］都 可能參與了PH的發(fā)病及病理生理過程。miRNA－126－3p存在于哺乳動物內(nèi)血管豐富的組織中，是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)miRNA，主要調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的生物合成、血管發(fā)育和維持血管的完整性，是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［6－8］。而動脈性肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）的發(fā)病機(jī)制主要與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)［9－11］。因此，本研究設(shè)想 miRNA－126－3p與先天性心臟病導(dǎo)致的PH有關(guān)，從基因、蛋白等水平對miRNA－126－3p與先天性心臟病導(dǎo)致的PH的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2014年1月至2015年1月入院的先天性心臟病患者25例作為研究對象，其中，PH患者11例（PH組），非PH患者14例（對照組）?；颊呷朐汉筮M(jìn)行右心導(dǎo)管檢查測壓。25例患者均取肺組織進(jìn)行病理檢查，心外科行手術(shù)治療取下組織后，留取少量組織于－80℃冰箱內(nèi)凍存，以備后續(xù)實驗。兩組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），且兩組患者在性別、病史、生化檢查結(jié)果方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而肺動脈壓力方面比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．000 1），PH組患者肺動脈壓力最小為30mm Hg，最大為45 mm Hg，而對照組患者肺動脈壓力全部小于25mm Hg。兩組患者一般資料比較見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1．2 miRNA實時熒光定量檢測 miRNA提取（miRcute miRNA提取分離試劑盒，DP501）、逆轉(zhuǎn)錄（miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR201）、熒光定量（miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒SYBR Green，F(xiàn)P401）、miRNA－126－3p（UCG UAC CGU GAG UAA UAA UGC G）熒光定量上游引物（hsa－miR－126－3p qPCR Primer，CD201－0058）、下游通用引物等試劑盒均由廣州真知生物有限公司提供，實驗方法皆按照試劑盒說明書進(jìn)行。熒光定量檢測步驟：94℃變性2min；PCR循環(huán)中模板94℃變性20s；60℃退火、延伸34s；共30個循環(huán)，U6為內(nèi)參。本研究采用2－ΔCt相對定量方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：ΔCt（PH組）＝Ct（實驗組目標(biāo)基因）－Ct（實驗組內(nèi)參基因）；ΔCt（對照組）＝Ct（對照組目標(biāo)基因）－Ct（對照組內(nèi)參）。

1．3 miRNA－126－3p生物信息學(xué)預(yù)測 采用生物信息學(xué)軟件starBase［12－13］（http：／／starbase．sysu．edu．cn）預(yù)測 miRNA－126－3p的生物學(xué)功能、靶基因、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路和其長鏈非編碼 RNA（long non－coding，lncRNA）、競爭性內(nèi)源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）、環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）。

1．4 qRT－PCR 首先，用 TRIZOL試劑（Invitrogen，美國）按照說明書提取所獲取肺組織的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書將所提取RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后按照實時熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書進(jìn)行熒光定量：95℃預(yù)變性30s；95℃擴(kuò)增、延伸15s；60℃退火30s；共40個循環(huán)。血管內(nèi)皮生長A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）PCR引物由英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成。其上游引物：AAT CCC GGT ATA AGT CCT G，下游引物：AAA TGC TTT CTC CGC TCT，產(chǎn)物片段大小為112kb，以β－actin作為內(nèi)參。采用2－ΔCt相對定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：ΔCt（實驗組）＝Ct（實驗組目標(biāo)基因）－Ct（實驗組內(nèi)參基因）；ΔCt（對照組）＝Ct（對照組目標(biāo)基因）－Ct（對照組內(nèi)參）。

1．5 Western blot檢測 首先，將所獲取的組織取約50mg提取其蛋白質(zhì)，采用BCA法測量其蛋白濃度，繼而進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、VEGFA一抗（購自武漢博士德生物有限公司）孵育、二抗孵育、雜交、顯影、曝光。VEGFA稀釋比例1∶400，內(nèi)參選用β－actin（稀釋比例1∶1 000，購自武漢博士德生物有限公司），其余相關(guān)試劑和材料均購自碧云天生物技術(shù)研究所。結(jié)果分析用Image J圖像分析軟件計算條帶灰度值，最后結(jié)果為目的條帶灰度值／內(nèi)參條帶灰度值。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5（GraphPad Software Inc，CA，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有定性資料采用χ2檢驗或Fisher檢驗；計量資料采用x±s表示，采用t檢驗進(jìn)行分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 肺組織中miRNA－126－3p實時熒光定量結(jié)果 經(jīng)過肺組織miRNA提取、逆轉(zhuǎn)錄，并行實時熒光定量檢測，發(fā)現(xiàn)PH組miRNA－126－3p的表達(dá)水平（0．325 8±0．028）與對照組（0．036±0．009）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），見圖1。

圖1 miRNA－126－3p實時熒光定量結(jié)果分析

圖1 miRNA－126－3p實時熒光定量結(jié)果分析

2．2 miRNA－126－3p生物信息學(xué)分析 采用starBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNA－126－3p的生物學(xué)功能、靶基因及KEGG信號通路，見表2。從預(yù)測結(jié)果可知：miRNA－126－3p的生物學(xué)功能主要與結(jié)合蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、調(diào)控MAPK和胰島素受體信號通路等有關(guān)；其KEGG信號通路主要是胰島素受體信號通路和Jak－STAT 信號通路；PANTHER預(yù)測其主要功能是促進(jìn)血管生成。miRNA－126－3p靶基因（至少有2個在線軟件得到同一結(jié)果，共73個預(yù)測靶基因）主要有：VEGFA、SPRED1、PIK3R2、PARP16、TNFRSF11B、ADAM9、SLC7A5、AKAP13等。結(jié)合其生物學(xué)功能及靶基因，本研究假定VEGFA為其靶基因，進(jìn)行后續(xù)驗證實驗。

表2 miRNA－126－3p的KEGG信號通路預(yù)測

續(xù)表2 miRNA－126－3p的KEGG信號通路預(yù)測

2．3 VEGFA mRNA表達(dá)結(jié)果及相關(guān)性分析 提取兩組患者肺組織的總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量檢測VEGFA在兩組樣本的表達(dá)水平（圖2A），PH組患者VEGFA的表達(dá)水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。miRNA－126－3p與VEGFA相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者呈正相關(guān)（圖2B），相關(guān)度為0．702 1，Pearson 相關(guān)系數(shù)為 0．837 9，95%CI 為（0．661 9～0．926 4），P＜0．000 1。

圖2 VEGFA實時熒光定量結(jié)果分析及相關(guān)性分析

2．4 PH組與對照組肺組織VEGFA蛋白表達(dá)情況比較 對所收集患者的肺組織進(jìn)行蛋白定量分析，結(jié)果提示PH組患者VEGFA蛋白的表達(dá)水平較對照組明顯升高，見圖3。

圖3 兩組患者肺組織VEGFA蛋白表達(dá)結(jié)果及定量統(tǒng)計分析

3討 論

PH是臨床越來越常見的一種疾病，其類型眾多，而且其發(fā)病機(jī)制尚未明確。目前研究表明PH發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、血管內(nèi)皮功能障礙、平滑肌細(xì)胞功能紊亂等有關(guān)。關(guān)于遺傳機(jī)制，目前多認(rèn)為骨形成蛋白Ⅱ型受體（BMPR2）、激活素受體樣激酶1（ALK1）等基因可能通過遺傳方式導(dǎo)致PH發(fā)生，而且主要是導(dǎo)致PAH的發(fā)生。目前，大多數(shù)研究較為認(rèn)可的主要發(fā)病機(jī)制是各種原因?qū)е碌难軆?nèi)皮功能障礙和（或）平滑肌細(xì)胞功能紊亂而導(dǎo)致PH發(fā)生［14］。miR－126－3p被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)miRNA，與血管生成等有關(guān)，可能參與血管內(nèi)皮生長因子信號通路的調(diào)控［15－16］。本研究通過對PAH患者的miRNA水平、mRNA水平、蛋白等水平研究發(fā)現(xiàn)，先天性心臟病PH患者肺組織的miR－126－3p的表達(dá)較對照組有明顯差異；通過對miR－126－3p的生物學(xué)功能及靶基因等預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR－126－3p可能參與血管形成，并調(diào)控靶基因VEGFA的表達(dá)；后續(xù)基因水平和蛋白水平試驗發(fā)現(xiàn)PH組VEGFA的mRNA及蛋白都較對照組有明顯差異。各水平研究表明，miR－126－3p可能通過調(diào)控VEGFA而導(dǎo)致PH的發(fā)生。

本研究只是miR－126－3p與PH發(fā)病機(jī)制的一個初步研究，其具體調(diào)控機(jī)制還有待后續(xù)細(xì)胞實驗及動物實驗等驗證，而且本研究樣本量較少，還有待大樣本研究進(jìn)行驗證及篩選相關(guān)標(biāo)志物。本研究在進(jìn)行生物信息學(xué)分析時，還對miR－126－3p的ceRNA、circRNA、lncRNA都進(jìn)行了分析，ceRNA可與miR－126－3p共同結(jié)合 miRNA 作用元件［17］，可以聯(lián)合分析miRNA的具體作用機(jī)制；miRNA和circRNA由于其穩(wěn)定、特異、高豐度的表達(dá)特性［18］，都可以作為疾病標(biāo)志物研究，在先天性心臟病相關(guān)性PH研究可以相輔相成；lncRNA也可以作為標(biāo)志物而進(jìn)行相關(guān)研究［19］。分析發(fā)現(xiàn) miR－126－3p的lncRNA為 XIST（X inactive specific transcript，non－protein coding），其circRNA 為PLXNB2（Plexin B2），其ceRNA有PLXNA3、FNDC3B、RBM33、SS18L1、ZNF326、CRAMP1L、ZNF292、YEATS2、NOM1、SIN3B、ZC3H11A、CPOX、ZSWIM4、BHLHE40、ZNF532、YOD1、SLC2A3、USP31。如果后續(xù)研究從ceRNA、circRNA、lncRNA、基因、蛋白等多個水平進(jìn)行研究，可以為PH的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)闡述，為其實驗研究和臨床診治提供理論支持。

［1]Paulin R，Michelakis ED．The metabolic theory of pulmonary arterial hypertension［J］．Circ Res，2014，115（1）：148－164．

［2]Potus F，Graydon C，Provencher S，et al．Vascular remodeling process in pulmonary arterial hypertension，with focus on miR－204and miR－126 （2013Grover Conference series）［J］．Pulm Circ，2014，4（2）：175－184．

［3]Wang S，Aurora AB，Johnson BA，et al．The endothelialspecific microRNA miR－126governs vascular integrity and angiogenesis［J］．Dev Cell，2008，15（2）：261－271．

［4]Urbich C，Kuehbacher A，Dimmeler S．Role of microRNAs in vascular diseases，inflammation，and angiogenesis［J］．Cardiovasc Res，2008，79（4）：581－588．

［5]Lei W，Li G，Zheng J，et al．Roles of microRNA in vascular diseases in cardiac and pulmonary systems［J］．Pharmazie，2014，69（9）：643－647．

［6]Fish JE，Santoro MM，Morton SU，et al．miR－126regulates angiogenic signaling and vascular integrity［J］．Dev Cell，2008，15（2）：272－284．

［7]Kim GH，Ryan JJ，Marsboom G，et al．Epigenetic mechanisms of pulmonary hypertension［J］．Pulm Circ，2011，1（3）：347－356．

［8]Ge HY，Han ZJ，Tian P，et al．VEGFA expression is inhibited by Arsenic trioxide in HUVECs through the upregulation of Ets－2and miRNA－126［J］．PLoS One，2015，10（8）：e0135795．

［9]Zhang HD，Zhang R，Jiang X，et al．Effects of oral treatments on clinical outcomes in pulmonary arterial hypertension：a systematic review and meta－analysis［J］．Am Heart J，2015，170（1）：96－103．

［10］Parikh KK．Use of outcome measures in pulmonary hypertension clinical trials［J］．Am Heart J，2015，170（3）：419－429．

［11］Vaidya B，Gupta V．Novel therapeutic approaches for pulmonary arterial hypertension：Unique molecular targets to site－specific drug delivery［J］．J Control Release，2015，211（1）：118－133．

［12］Li JH，Liu S，Zhou H，et al．starBase v2．0：decoding miRNA－ceRNA，miRNA－ncRNA and protein－RNA interaction networks from large－scale CLIP－Seq data［J］．Nucleic Acids Res，2014，42（Database issue）：D92－D97．

［13］Yang JH，Li JH，Shao P，et al．starBase：a database for exploring microRNA－mRNA interaction maps from argonaute CLIP－Seq and Degradome－Seq data［J］．Nucleic Acids Res，2011，39（Database issue）：D202－D209．

［14］Bienertova－Vasku J，Novak J，Vasku A．MicroRNAs in pulmonary arterial hypertension：pathogenesis，diagnosis and treatment［J］．J Am Soc Hypertens，2015，9（3）：221－234．

［15］Zhou G，Chen T，Raj JU．MicroRNAs in pulmonary arterial hypertension［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2015，52（2）：139－151．

［16］Meloche J，Pflieger A，Vaillancourt M，et al．miRNAs in PAH：biomarker，therapeutic target or both？［J］．Drug Discov Today，2014，19（8）：1264－1269．

［17］Salmena L，Poliseno L，Tay Y，et al．A ceRNA hypothesis：the Rosetta Stone of a hidden RNA language？［J］．Cell，2011，146（3）：353－358．

［18］Jeck WR，Sorrentino JA，Wang K，et al．Circular RNAs are abundant，conserved，and associated with ALU repeats［J］．RNA，2013，19（2）：141－157．

［19］Brosnan CA，Voinnet O．The long and the short of noncoding RNAs［J］．Curr Opin Cell Biol，2009，21（3）：416－425．