糖基因ST8SIA4在人慢性粒細胞白血病多藥耐藥中的作用研究

張兆海，張瑞紅

（1．遼寧省本溪市金山醫(yī)院檢驗科 117000；2．遼寧省本溪鋼鐵集團總醫(yī)院手術室 117000）

人慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種骨髓異常增生的惡性腫瘤，由于供體來源少、移植死亡率高、失敗率高，移植治療的應用受到了限制，故在臨床上化療成為了CML治療的首選方法［1］。然而臨床數(shù)據(jù)顯示，大多的CML患者對化療藥物都有一定的耐藥性，阻礙了對CML的治療［2］?，F(xiàn)在已有資料顯示，腫瘤耐藥細胞表面糖鏈結構及表達都存在差異，而糖基化廣泛存在于各種生理過程中［3］，N－糖基化修飾、糖基因（glycogene）的改變均與白血病多藥耐藥具有相關性［4］。唾液酸又名N－乙酰基神經(jīng)氨酸，唾液酸作為機體內(nèi)重要的信息傳遞分子，可參與細胞表面糖蛋白和糖脂的唾液酸化修飾，在細胞黏附、抗原識別和信號傳導等過程中發(fā)揮著重要的作用。有研究報道，ST8SIA1在兒童急性淋巴細胞白血病中呈低表達［5］。人急性髓性白血?。ˋML）多藥耐藥與ST8SIA4的特征性改變具有相關性［6］。另外，唾液酸在細胞膜上的表達還與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系［7－8］。因此，本實驗旨在探討ST8SIA家族與CML多藥耐藥的相關性及其可能的機制，從而為診斷CML多藥耐藥提供新的檢測標志物，為逆轉(zhuǎn)CML多藥耐藥提供新策略。

1 材料與方法

1．1 主要材料及試劑 CML細胞株KCL22，購自凱基公司（中國南京）。裸鼠（雄性，4周齡，體質(zhì)量17～23g，清潔級），胎牛血清、RPMI－1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素（均由GIBCO公司提供），胰酶（Sigma公司）、Trizol（Invitrogen公司）、RT－PCR試劑盒、PCR試劑盒（TaKaRa公司）、PCR引物（大連寶生物公司）、ECL試劑盒（Amersham Biosciences公司）、PVDF膜（Pall公司）、兔抗小鼠多克隆抗體、辣根酶標記羊抗兔抗體（均由Santa公司提供）、其他試劑國產(chǎn)分析純化。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養(yǎng) KCL22細胞在含滅活的10%胎牛血清，1%雙抗（青霉素100μg／mL，鏈霉素100μg／mL）的 RPMI－1640培養(yǎng)基中，于37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導KCL22細胞對阿霉素（ADR）的耐藥。實驗前1周，KCL22／ADR細胞應在無ADR的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，且使細胞的活力大于90%。所有實驗均在細胞處于對數(shù)生長期進行。

1．2．2 患者標本 收集2012年7月至2014年6月來自本溪市金山醫(yī)院和本溪鋼鐵集團總醫(yī)院就診的28例CML患者，其中，男17例，女9例，年齡19～68歲，中位年齡45歲。經(jīng)入院檢測，其中，11例為CML非耐藥（P－gp檢測為陰性，CML／－）患者，17例為 CML耐藥（P－gp檢測為陽性，CML／＋）患者。所有的患者外周血標本應在未接受任何治療前采集，并用人淋巴細胞分離液，分離外周血單個核細胞，分離出的細胞保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1．2．3 RNA提取和RT－PCR 常規(guī)Trizol法提取各標本的總RNA，紫外分光光度計測定吸光度（A）260和A280，以檢測RNA含量和純度，并置于－70℃保存。取相同質(zhì)量的RNA作為模板，以20μL反轉(zhuǎn)錄體系，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書進行操作。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按照TaKaRa RTPCR試劑盒說明構建25μL反應體系，置于熒光定量PCR儀中40個循環(huán)，同時擴增管家基因GAPDH作為對照。根據(jù)比較Ct值 法 公 式 2－ΔΔCt，其 中，ΔΔCt＝ 實 驗 組 （Ct目的基因－Ct管家基因）－對照組（Ct目的基因－Ct管家基因），獲得不同組間相關基因表達比值。所用到的引物見表1。

表1 RT－PCR擴增6種目的基因及GAPDH的引物序列

1．2．4 Western blot分析 用2×電泳緩沖液裂解細胞，離心取上清，蛋白濃度由BCA法檢測。煮沸變性的蛋白以每孔40μg的含量點樣，經(jīng)濃縮膠為6%、分離膠為10%的十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離。通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白樣品移至PVDF膜上，37℃5%脫脂奶粉封閉2h。分別與1∶200兔抗小鼠ST8SIA家族抗體、GAPDH多克隆抗體4℃孵育過夜。以TTBS洗膜3次，每次10min。然后加HRP標記的羊抗兔IgG（1∶3 000稀釋）37℃孵育1 h，隨后以TTBS洗膜3次，每次10min。ECL發(fā)光試劑盒檢測結果。

1．2．5 RNA干擾分析 取1mL（約1×104個）對數(shù)期生長的KCL22或KCL22／ADR細胞懸液于24孔板中，在37℃，含5%CO2孵箱中培養(yǎng)1～2d使細胞達到60%～80%的匯合度。取100μL無血清的RPMI－1640培養(yǎng)液與1μg帶shRNA的質(zhì)?；靹?，再加入2μL TurboFect轉(zhuǎn)染試劑混勻，最后取100μL該混合液加入孔板中，輕輕混勻，置于37℃孵箱中培養(yǎng)24～48h。待轉(zhuǎn)染完成之后，收集細胞，RT－PCR、Western blot分析檢測干擾效果。

1．2．6 體外藥敏實驗 采用MTT法檢測白血病細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。取對數(shù)生長期細胞（1×104個）接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。分別加入不同濃度梯度的抗腫瘤藥物阿霉素、長春新堿和紫杉醇繼續(xù)培養(yǎng)72h。各孔再加入5mg／mL的 MTT 20μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。各孔再加入100μL三聯(lián)裂解液終止培養(yǎng)，過夜。應用酶標儀于570nm波長處測定各孔光密度（OD）值。計算IC50值，即抗腫瘤藥物的半數(shù)抑制濃度。實驗中設陰性對照孔（不加抗腫瘤藥物）和調(diào)零孔（只加細胞培養(yǎng)液和抗腫瘤藥物，不加細胞）。

1．2．7 體內(nèi)藥敏實驗 細胞培養(yǎng)后分為6組：KCL22、KCL22／ADR、KCL22－control shRNA、KCL22／ADR－control shRNA、KCL22／ADR－ST8SIA4shRNA、KCL22－ST8SIA6 shRNA組，然后從腋窩下注射癌細胞培養(yǎng)液（細胞數(shù)約1×107），待瘤塊直徑達5mm×5mm時開始給予ADR抗腫瘤治療?？瞻讓φ战M每隔3d腹腔注射生理鹽水，ADR治療組每隔3d腹腔注射ADR（4mg／kg）。觀察3周，殺鼠取瘤體量體積。

1．2．8 免疫組織化學實驗 采用SP法進行免疫組織化學法染色，經(jīng)過不同處理的小鼠處死后瘤體固定于10%多聚甲醛24h以上，隨后浸蠟、包埋和切片。固定好的瘤體經(jīng)二甲苯和不同梯度乙醇脫蠟水化，用檸檬酸緩沖液進行高壓抗原修復，3%過氧化氫阻斷過氧化物酶，PBS洗3次，滴加封閉液進行封閉。一抗按1∶50～1∶100比例稀釋，孵育2h。將生物素化鼠抗兔IgG二抗滴加于組織切片上，37℃孵育1h，PBS洗3次，DAB顯色，隨后蘇木精復染核，梯度乙醇常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察細胞核或細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒即為陽性結果。在400倍視野下計數(shù)3個視野的陽性細胞數(shù)，取其平均值。

1．3 統(tǒng)計學處理 所采用SPSS13．0軟件進行統(tǒng)計分析。每一項實驗至少有3次結果。數(shù)值用x±s表示，采用t檢驗。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 ST8SIA4在CML中的差異表達 RT－PCR結果顯示，在KCL22／ADR細胞中，ST8SIA4的表達量較KCL22細胞顯著增加，約為5．2倍（圖1A）。Western blot分析進一步驗證了蛋白表達水平同樣的趨勢（圖1B）。

圖1 ST8SIA4在KCL22和KCL22／ADR細胞中的差異表達

通過對28例臨床患者PBMC分析，ST8SIA2、ST8SIA3幾乎不表達；ST8SIA1和ST8SIA5有較高的表達量，但耐藥與非耐藥患者間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）；而ST8SIA4的表達在耐藥與非耐藥標本間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表2。

表2 ST8SIA4在CML患者標本中的表達水平比較（x±s）

2．2 特異性下調(diào)ST8SIA4表達對KCL22／ADR細胞耐藥性的影響 與 KCL22／ADR 細胞及 KCL22／ADR－control shRNA細胞相比，干擾ST8SIA4后的KCL22／ADR細胞株在mRNA和蛋白水平上表達均顯著降低，見圖2。

進一步驗證下調(diào)ST8SIA4對KCL22／ADR細胞抗腫瘤藥物化學敏感性的影響，體外藥敏實驗結果顯示（圖3A），作用于KCL22／ADR－ST8SIA4shRNA1細胞的抗腫瘤藥物的IC50值明顯低于KCL22／ADR－control shRNA細胞的IC50值。體內(nèi)藥敏實驗顯示（圖3B），干擾ST8SIA4后，KCL22／ADR細胞平均瘤體積減小。免疫組織化學結果顯示，干擾后的KCL22／ADR細胞的ST8SIA4的陽性表達率明顯下降（圖3C）。

圖2 特異性下調(diào)ST8SIA4在KCL22／ADR細胞中的表達

圖3 特異性下調(diào)ST8SIA4表達對KCL22／ADR細胞耐藥性的影響

3 討 論

白血病是一類常見的嚴重危害人類健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤［9］?；熓前籽≈委煴夭豢缮俚氖侄沃唬籽〖毎麑熕幬锏拿舾行允菦Q定化療的關鍵，尋找新的治療白血病耐藥細胞株的靶點，對白血病的治療具有重要意義［10］。白血病細胞常對臨床上傳統(tǒng)使用的多種化療藥物呈現(xiàn)出其內(nèi)源性或獲得性的藥物耐受性，即多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR），也是目前白血病治療中最大的難題［11］。本研究糖基因ST8SIA4在CML耐藥與非耐藥患者標本間，以及CML細胞株KCL22與KCL22／ADR間mRNA和蛋白的表達差異，探討糖基因ST8SIA4介導白血病多藥耐藥的可能機制。結果表明糖基因ST8SIA4在耐藥患者中mRNA表達水平明顯高于非耐藥患者；下調(diào)糖基因ST8SIA4表達水平增加了KCL22／ADR細胞體內(nèi)、體外對腫瘤藥物的敏感性，減小平均腫瘤體積。糖基因是一組編碼糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶等糖類相關的基因［12］。唾液酸轉(zhuǎn)移酶是糖基轉(zhuǎn)移酶中的一類，唾液酸作為識別位點，參與細胞識別及信息傳遞，其表達調(diào)控還與腫瘤細胞的多藥耐藥性密切相關［13］。在各類型腫瘤的治療過程中，異常表達的唾液酸化的糖復合物通常作為潛在的治療靶點，腫瘤細胞膜上唾液酸化的糖復合物的異常表達通常導致惡性腫瘤細胞特性的改變［14］。而唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶是催化唾液酸化的糖復合物合成必不可少的因素之一。在近期的報道中，ST8SIA4蛋白的高表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也有很大的作用，在急性粒細胞白血病細胞株及其耐ADR細胞株中，ST8SIA4的表達量具有顯著差異［15］。盡管臨床上對CML患者的化療已有明顯的改善和提高，但腫瘤細胞的多藥耐藥仍然是一個重大挑戰(zhàn)。本研究進一步證實ST8SIA4在CML及其耐藥患者PBMC中的差異表達。因此，差異表達的ST8SIA4基因可成為潛在的CML耐藥標志物，從而為尋求逆轉(zhuǎn)藥物提供新策略和靶點。

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