多西紫杉醇納米脂質(zhì)體的制備及性質(zhì)考察*

李菲 張娜 郝吉福 王建筑 畢研平

(1.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012)

多西紫杉醇納米脂質(zhì)體的制備及性質(zhì)考察*

李菲1張娜2郝吉福1王建筑1畢研平1

(1.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016;2.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250012)

目的制備多西紫杉醇納米脂質(zhì)體，并考察其理化性質(zhì)和體外釋藥行為。方法采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備多西紫杉醇納米脂質(zhì)體，單因素考察法優(yōu)化處方。透射電鏡觀察脂質(zhì)體的形態(tài)，動態(tài)激光散射法測定粒徑分布、Zeta電位，反透析法測定包封率，動態(tài)膜透析法考察體外釋藥行為。結(jié)果最佳處方為:藥脂比1∶15，膽固醇、磷脂質(zhì)量比1∶8，有機(jī)相/水相比例為5∶1。優(yōu)化條件下制備的多西紫杉醇脂質(zhì)體的粒徑為(200.3± 3.7)nm，Zeta電位-15.10 mV，包封率為(90.76±1.42)﹪，體外釋放符合Higuchi方程。結(jié)論制備的多西紫杉醇脂質(zhì)體粒徑均勻、包封率高，優(yōu)化的處方工藝可行。

多西紫杉醇;納米脂質(zhì)體;制備;體外釋放

多西紫杉醇(Docetaxel，DTX)是由漿果紫杉(Taxus baccata，European yew)針葉中提取的前體物經(jīng)半合成得到的紫杉烷類抗癌藥物。其抗腫瘤機(jī)制與紫杉醇相同，是腫瘤細(xì)胞有絲分裂抑制劑，對多種癌癥都有良好療效，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)臨床上用于卵巢癌、乳腺癌以及非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌的治療［1］。多西紫杉醇的溶解性差，注射劑采用非離子表面活性劑吐溫-80(Tween-80)為增溶劑，可導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，且藥物的體內(nèi)分布缺乏選擇性，造成嗜中性粒細(xì)胞減少、血小板減少等劑量限制性不良反應(yīng)［2］。因此，需要開發(fā)能夠解決藥物溶解度問題和控制藥物釋放的速度和作用部位的新型給藥系統(tǒng)［3］，有研究將DTX制成脂質(zhì)納米粒、殼聚糖納米粒、溫敏膠束等，達(dá)到靶向、緩釋、毒副作用低、用藥方便等目的［4］。

脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物載體具有獨(dú)特優(yōu)勢，藥物經(jīng)脂質(zhì)體包封后不僅可解決溶解度差的問題，還可改變其體內(nèi)分布，降低毒副作用，同時其類細(xì)胞結(jié)構(gòu)可減少腫瘤的耐藥性。目前臨床上已經(jīng)用于抗腫瘤的治療，如紫杉醇脂質(zhì)體已上市并取得了良好的應(yīng)用效果［5］，說明脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物載體具有良好的應(yīng)用前景。本文以包封率為主要評價指標(biāo)，單因素考察法優(yōu)化處方，采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備粒徑均勻的多西紫杉醇納米脂質(zhì)體。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52-98(上海亞榮生化儀器廠);高壓勻質(zhì)機(jī)(意大利Niro-Soaro型號NS1001L);LC-10ATVP-ODS高效液相色譜儀(日本島津);SPD-10AVP紫外檢測器(日本島津); ZETASIZER3000粒度分布與電勢分析儀(英國Malvern公司);JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子公司)。

1.2 試藥

多西紫杉醇(上海源葉生物科技有限公司，批號:114977-28-5，純度≥98﹪);Duopafei(齊魯制藥有限公司，批號:2070162TA);注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)，批號:20120201);膽固醇(上海化學(xué)試劑站分裝廠);甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件［6］Hypersil ODS柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流動相:乙腈—蒸餾水(65∶35);流速:1.0 ml·min-1;檢測波長:230 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20 μl。

2.1.2 線性關(guān)系考察精密稱取DTX標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用乙腈—蒸餾水(65∶35)定容至10 ml，作為對照品儲備液。對照品儲備液進(jìn)行稀釋得到質(zhì)量濃度分別為5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 μg· ml-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，均進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積。以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=12684C-722.76，r=0.9998。結(jié)果表明，DTX在5～50 μg·ml-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 脂質(zhì)體的制備采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備DTX脂質(zhì)體。精密稱取藥物、注射用大豆磷脂和膽固醇，加入無水乙醇超聲溶解，40℃恒溫水浴下減壓蒸發(fā)形成薄膜，加入pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)，旋轉(zhuǎn)、超聲水化。經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻(壓力800 bar，循環(huán)10次)制備DTX納米脂質(zhì)體。采用單因素考察藥脂比、磷脂和膽固醇比例、有機(jī)相/水相比例等因素對脂質(zhì)體包封率的影響。

2.2.1 藥脂比對包封率的影響固定磷脂、膽固醇質(zhì)量比為8∶1，有機(jī)溶劑、水的比例為5∶1，按照藥物與脂質(zhì)質(zhì)量比分別為1∶8，1∶10，1∶15，1∶20時制備空白脂質(zhì)體，測定脂質(zhì)體包封率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 藥脂比對脂質(zhì)體包封率的影響(n=3)

DTX為脂溶性藥物，進(jìn)入磷脂雙分子層中間區(qū)域。一定范圍內(nèi)，提高脂質(zhì)的比例有利于提高脂溶性藥物的包封率。由圖1可知，藥脂比為1∶15時，包封率最大;藥脂比為1∶20時，包封率沒有明顯改變。所以，藥脂比確定為1∶15。

2.2.2 磷脂和膽固醇比例對包封率的影響固定藥物與脂質(zhì)質(zhì)量比為1∶15，有機(jī)溶劑、水的比例為5∶1，按照膽固醇、磷脂質(zhì)量比分別為1∶8，1∶10，1∶15，1∶20時制備脂質(zhì)體，測定脂質(zhì)體包封率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 膽固醇和磷脂比例對包封率的影響(n=3)

由圖2可見，隨膽固醇比例增加，脂質(zhì)體包封率增加，當(dāng)膽固醇與磷脂的比例為1∶8時，包封率最高;膽固醇比例繼續(xù)增加時，包封率下降。

2.2.3 有機(jī)相/水相體積比對包封率的影響固定膽固醇與磷脂的質(zhì)量比為1∶8，藥物與脂質(zhì)的質(zhì)量比為1∶15，按有機(jī)相/水相體積比為3∶1，4∶1，5∶1，6∶1來制備多西他賽脂質(zhì)體，測定脂質(zhì)體包封率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 有機(jī)相/水相體積比對包封率的影響(n=3)

薄膜分散法制備脂質(zhì)體時水化過程比較重要，采用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)相和水相(pH7.4 PBS)比例將有利于提高包封率。由圖3可知，有機(jī)相和水相的體積比為5∶1時包封率最大。

2.2.4 驗證實驗單因素考察的結(jié)果表明，優(yōu)化的處方工藝為:藥脂比1∶15，磷脂、膽固醇質(zhì)量比為8∶1，有機(jī)相/水相比例為5∶1。按照上述方法制備三批產(chǎn)品，平均包封率為為(90.76±1.42)﹪(n= 3)。

2.3 脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑和電位

取脂質(zhì)體混懸液，加pH7.4 PBS稀釋，滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，用2.0﹪的磷鎢酸染色，自然干燥，于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)，見圖4?？梢娭|(zhì)體為球形囊狀，大小均勻。取適量脂質(zhì)體混懸液稀釋至一定倍數(shù)后，ZETASIZER3000激光粒度分析儀與電勢分析儀測定脂質(zhì)體粒徑和Zeta電位，結(jié)果見圖5，粒徑為200.3±3.7 nm，電位為-15.10± 2.11 mV(n=3)。

圖4 脂質(zhì)體透射電鏡照片(×100K)

圖5 脂質(zhì)體的粒度分布圖

2.4 包封率的測定［7］

2.4.1 方法回收率采用反透析法測定脂質(zhì)體的包封率。取空白脂質(zhì)體混懸液1.0 ml，再加入定量DTX原料藥，質(zhì)量記為Wa，用pH7.4 PBS稀釋至30 ml。精密量取含0.5﹪Tween-80的pH7.4 PBS 5 ml于已處理的透析袋內(nèi)，透析袋置于上述稀釋過的脂質(zhì)體混懸液中，室溫下磁力攪拌8 h。取透析袋內(nèi)的液體測定，記為游離藥物的質(zhì)量Wb。計算公式為:回收率=Wb/Wa×100﹪。平均回收率為(90.84±0.62)﹪，RSD=0.68﹪。回收率大于90﹪，表明可以用反透析法測定包封率。

2.4.2 包封率的測定精密吸取DTX脂質(zhì)體混懸液1.0 ml，用pH7.4 PBS稀釋至30 ml。按照“2.4.1”項下測定游離藥物的質(zhì)量WFree;精密吸取脂質(zhì)體一定量，加甲醇稀釋，進(jìn)樣，得到總藥量WTotal。按下式計算包封率:包封率(EE﹪)=(WTotal -WFree)/WTotal×100﹪。

2.5 體外釋放試驗

2.5.1 釋放介質(zhì)的選擇取過量DTX置于10 ml的具塞試管中，分別加入5 ml pH7.4PBS、含0.5﹪Tween-80的pH7.4PBS和1﹪Tween-80的pH7.4PBS，放入37±0.5℃的恒溫?fù)u床中震蕩12 h。取上清液，測定藥物在不同介質(zhì)中的溶解度。藥物在上述三種介質(zhì)中的溶解度分別為5.0，53.1，60.0 μg·ml-1。藥物在0.5﹪Tween-80的pH7.4PBS溶液和1.0﹪Tween-80的pH7.4PBS溶液中的溶解度接近，為了減少Tween-80的影響，選擇0.5﹪Tween-80的pH7.4PBS為釋放介質(zhì)。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取1mg·ml-1DTX貯備液適量，加0.5﹪Tween-80的pH7.4PBS稀釋為50 μg·ml-1，用蒸餾水分別稀釋為1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 μg·ml-1的系列溶液，分別進(jìn)樣20 μl，記錄峰面積。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C)為橫坐標(biāo)，A對C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A= 12538C+744.81，r=0.9997。結(jié)果表明:DTX在1～10 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。

2.5.3 釋放度測定采用動態(tài)膜透析法進(jìn)行脂質(zhì)體體外釋藥試驗，以Duopafei為對照，以含0.5﹪Tween-80的pH7.4PBS溶液為釋放介質(zhì)。精密吸取脂質(zhì)體混懸液2.0 ml裝入預(yù)處理過的透析袋(MW=8000-140000)中，將袋口扎緊，置于15 ml釋放介質(zhì)中，37℃恒溫振蕩，分別在1，2，4，8，12，24，36，60 h取出2.0 ml釋放介質(zhì)，同時補(bǔ)充新鮮釋放介質(zhì)。HPLC法測定釋放介質(zhì)中的藥物含量，計算累積釋放度。釋藥曲線見圖6，將累積釋放度和時間用釋藥模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1。

圖6 脂質(zhì)體和Duopafei在pH7.4PBS體外釋放曲線. (n=3，±s)

由圖6可知，Duopafei在介質(zhì)中釋藥較快，12 h時藥物已基本全部釋放;脂質(zhì)體混懸液釋藥曲線較平穩(wěn)，4 h釋藥大約25﹪，沒有突釋效應(yīng);12 h釋藥大約50﹪，24 h大約75﹪，釋藥平穩(wěn);48 h釋藥大約95﹪，釋藥完全。

表1 脂質(zhì)體和Duopafei體外釋藥行為的數(shù)學(xué)模型擬合

由表1可知，Duopafei體外釋藥符合一級動力學(xué)，而DTX脂質(zhì)體混懸液的體外釋藥更好地符合Higuchi方程。

3 討論

薄膜分散法制備脂質(zhì)體的關(guān)鍵是膜的形成，膜的組成與膜的形成密切相關(guān)，是影響包封率的主要因素。膽固醇分子能與磷脂的親水和親油基團(tuán)作用，填充磷脂分子間的空隙，增強(qiáng)膜的強(qiáng)度，并增加脂質(zhì)雙分子層的有序排列，從而提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。因此，適當(dāng)提高膽固醇的量可以提高脂溶性藥物的包封率。但膽固醇的量較大時，可增加脂質(zhì)雙分子層的不對稱性，膜的通透性增加，易于造成藥物的滲漏［8］。但是，過多的膽固醇可與多西他賽競爭磷脂雙分子層區(qū)域，抑制藥物的插入;膽固醇與磷脂分子的作用使得穿插在磷脂膜中間的藥物與磷脂的作用削弱，導(dǎo)致包封率的下降［9］。所以，磷脂和膽固醇的比例有個臨界點，當(dāng)采用這個臨界比例的時候包封率最高。實驗中曾使用氯仿和乙醚作為有機(jī)相，但是二者在35℃條件下?lián)]發(fā)性強(qiáng)，尤其是乙醚，成膜不均勻，不利于磷脂和膽固醇分子的順序排列，也不利于藥物的均勻分散。當(dāng)采用無水乙醇為有機(jī)相時，成膜性好，水化后，脂質(zhì)體的成型好。采用薄膜分散法制備的脂質(zhì)體粒徑在400 nm以上，且粒徑分布不均勻，經(jīng)高壓勻質(zhì)機(jī)乳勻(壓力800 bar，循環(huán)10次)制備得粒徑均勻的納米脂質(zhì)體，這個過程中包封率下降不明顯，說明薄膜分散法結(jié)合高壓均質(zhì)制備納米脂質(zhì)體是可行的。

包封率是脂質(zhì)體制劑質(zhì)量評價的重要指標(biāo)之一，與藥物的療效和毒副作用密切相關(guān)。一般來說，準(zhǔn)確測定包封率的關(guān)鍵是采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒂坞x藥物與脂質(zhì)體分離。反透析法是將脂質(zhì)體混懸液置于透析袋外，袋內(nèi)為透析介質(zhì)，受到分子量的限制只有游離藥物可擴(kuò)散進(jìn)入透析袋內(nèi)。實驗中測定不同時間點透析袋內(nèi)的藥物濃度，確定達(dá)到透析平衡的時間為8 h，根據(jù)總藥物濃度和游離藥物濃度計算包封率。用反透析法測定時，脂質(zhì)體周圍的游離藥物稀釋倍數(shù)較小，可以較好地避免打破脂質(zhì)體和游離藥物之間的動態(tài)平衡，從而導(dǎo)致藥物的滲漏［7］。方法回收率結(jié)果大于90﹪，表明用反透析法測定包封率是可行的。

體外釋放試驗中釋放介質(zhì)的選擇應(yīng)能滿足漏槽條件，即藥物完全釋放時溶液中藥物濃度應(yīng)遠(yuǎn)低于其飽和濃度。實際上，對于DTX這樣的難溶性藥物而言，水中的溶解度為5.0 μg·ml-1，加入一定量的表面活性劑能顯著增加其溶解度。在0.5﹪Tween-80的pH7.4PBS中，DTX的溶解度為53.1 μg·ml-1，控制該溶解度是最終藥物濃度3～5倍，滿足漏槽條件的要求。

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Preparation and characterization of docetaxel nanoliposomes

LI Fei1ZHANG Na2HAO Ji-fu1WANG Jian-zhu1BI Yan-ping1
(1.Dept.of Pharmacy，Taishan Medical University，Taian 271016，China; 2.Dept.of Pharmacy，Shangdong University，Jinan 250012，China)

Objective:OBJECTIVE To prepare docetaxel nanoliposomes and investigate their physico-chemical properties and release profile in vitro.Methods:Docetaxel liposomes were prepared by film dispersion-high pressure homogenization technology.The formulation was optimized using single factor screening.Transmission electron microscopy was used to study the shape.The diameter and Zeta potential was measured by dynamic light scattering.Retrodialysis method was used to determine the entrapment efficiency of the liposomes.In vitro drug release of the liposomes was investigated using dialysis method.Results:TS The optimized formulation was as follows:m(drug)∶m(lipids)=1∶15，m(cholesterol): m(soya lecithin)=1∶8，organic phase/aqueous solution ratio was 5∶1.The mean diameter of the liposomes was (200.3±3.7)nm with Zeta potential of-15.10 mV，and the entrapment efficiency was(90.76±1.42)﹪.The in vitro drug release profile was fitted with Higuchi equation.Conclusion:The uniform nanoliposomes with high entrapment efficiency indicated the optimized formulation was feasible.

docetaxel;nanoliposome;preparation;in vitro release

R917

A

1004-7115(2015)10-1096-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.10.005

山東省高等學(xué)校科技計劃項目(J13LM01)

李菲(1980—)，女，山東泰安人，講師，碩士，主要從事藥劑學(xué)教學(xué)和科研工作。

2015-7-8)