HPLC-MS/MS測定魚罐頭中乙二胺四乙酸二鈉殘留量

張曉華，曾繁華，張銳夫

（1.牡丹江市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗檢測中心，黑龍江牡丹江157021；2.大連出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116611；3.牡丹江出入境檢驗檢疫局，黑龍江牡丹江157005）

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）是GB2760 允許使用的一種食品添加劑[1]，可與鐵、銅、鈣、鎂等多價離子螯合成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，利用其絡(luò)合作用來防止由金屬引起的變色、變質(zhì)、變濁及維生素C 的氧化損失，起到護色、抗氧化作用[2]。由于其良好的添加效果，常被作為抗氧化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和凝固劑而廣泛的應(yīng)用于加工食品中[3]，但過多的乙二胺四乙酸二鈉被人食入后，會對人身造成傷害，其每日允許攝入量（ADI）值為0～205mg·kg-1。國外對EDTA 在食品中的殘留量有嚴(yán)格的限量規(guī)定。日本規(guī)定罐頭食品中EDTA 的殘留（以乙二胺四乙酸二鈉鈣計）不得超過250mg·kg-1,飲料中不得超過35mg·kg-1[4]。我國在八寶粥等罐頭食品中規(guī)定不得超過250mg·kg-1[1]。

目前，有關(guān)于食品中乙二胺四乙酸二鈉殘留量國內(nèi)報道很多[5-8]，但針對魚罐頭食品中乙二胺四乙酸二鈉殘留量檢測無文獻報道，大多采用液相色譜法進行檢測，樣品經(jīng)水提取，經(jīng)CuCl2或三氯化鐵衍生后，采用離子對試劑和C18柱進行液相色譜分析檢測，測定低限達(dá)50～100mg·kg-1。國外有關(guān)食品中乙二胺四乙酸二鈉的含量檢測的文獻報道不多，Takashi Hamano 等人采用分光光度法測定食品中乙二胺四乙酸二鈉的含量[9]，利用三氯化鐵衍生后進行分析檢測，線性范圍在0.5～40.0μg·cm-3；Brilliantes,S 等人采用液相色譜法測定罐裝海產(chǎn)品中乙二胺四乙酸二鈉的含量[10]，用弱乙酸提取，經(jīng)CuCl2衍生后，采用C8柱進行液相色譜分析檢測，線性范圍為25.1～301.7mg·kg-1；Carolina E. Cagnasso 等人采用液相色譜法測定非酒精飲料中乙二胺四乙酸二鈉的含量[11]，定量限為2.0mg·L-1；Ralph Fingerhut等人在新生兒篩查中采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定干血漿樣品中乙二胺四乙酸二鈉的含量[12]，樣品經(jīng)四丁醇酯化后，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進行測定，方法的定量限為84μmol·L-1；Congmin Z.Xie 等人采用反相離子對液相色譜法測定生活廢水中乙二胺四乙酸二鈉的含量[13]，定量限為0.005mg·L-1；Jos'e Benito Quintana 等人采用反相離子對液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定水中乙二胺四乙酸二鈉的含量[14]，定量限為0.001mg·kg-1。本研究的關(guān)鍵是采用三氯化鐵衍生化、三氯甲烷和MAX 陰離子交換柱凈化，用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀檢測和確證，外標(biāo)法定量,取得了滿意的結(jié)果。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點，能滿足國內(nèi)外檢測限量要求。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

甲醇、三氯甲烷、三正丁胺（均為色譜純）美國Fisher 公司；甲酸（88%，A.R.國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；HAc（A.R.天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；HCl（優(yōu)級純天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）；FeCl3（A.R.天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品（CAS:6381-92-6，純度大于等于99%購自Sigma-Aldrich 公司）；實驗用水均為去離子水；MAX 陰離子交換柱（150mg，6mL 美國Waters 公司）；水相濾膜（0.22μm奧特賽恩斯公司）；

0.02mol·L-1FeCl3溶液：稱取0.5406g FeCl3，溶于90mL 水中，轉(zhuǎn)移到100mL 容量瓶中，加入HCl 0.03mL，用水定容至刻度，混勻；

10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 值為3.5）：移取100mL 甲醇，溶于880mL 水中，加入1.17 mL 三正丁胺，用HAc 調(diào)節(jié)pH 值至3.5，轉(zhuǎn)移到1000mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混勻；

95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 值為3.5）：移取950mL 甲醇,溶于30mL 水中，加入1.17mL三正丁胺，用HAc 調(diào)節(jié)pH 值3.5，轉(zhuǎn)移到1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻；

10%甲酸甲醇水溶液：移取10mL 甲酸，溶于40mL 水中，轉(zhuǎn)移到100mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻。

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量的乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100mL 棕色容量瓶中，分別得濃度為10mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，此溶液轉(zhuǎn)移至儲液瓶中4℃下儲存一個月。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確吸取乙二胺四乙酸二鈉儲備溶液10mL 于50mL 棕色容量瓶中，用水稀釋成濃度為2mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，此溶液轉(zhuǎn)移至儲液瓶中4℃下儲存一個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要使用前用空白樣品基質(zhì)配制適當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

MAX 陰離子交換柱：使用前依次用5mL 甲醇、5mL 水活化。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Quattro Premier 超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（配ESI-電離源）（美國Waters 公司）；電子天平（感量0.01mg，0.01g 梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；組織搗碎機（上海精科實業(yè)有限公司）；離心機（5 000r·min-1湘儀離心機儀器有限公司）；旋渦混合器（德國IKA 公司）；均質(zhì)器（德國IKA 公司）；超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；氮吹儀（美國Organomation 公司）；50mL 螺旋蓋聚丙烯離心管；25、50mL 玻璃具塞離心管。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenyl 柱，50mm×2.1mm（內(nèi)徑），粒度1.7μm，或相當(dāng)者；流動相:見梯度洗脫程序表1；流速：0.25mL·min-1；柱溫：25℃；進樣量：5μL。

表1 梯度洗脫程序表Tab.1 Gradient program of mobile phase

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI,負(fù)模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；源溫度：110℃；去溶劑氣流量：550L·hr-1；N2氣；去溶劑溫度：350℃；錐孔氣流量：50L·hr-1,N2；碰撞氣壓力：3.30×10-4KPa,Ar，純度≥99.999%；毛細(xì)管電壓：3.0kV；其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 乙二胺四乙酸二鈉衍生物的定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞氣能量Tab.2 MRM transitions of precursor/product ion for qualitative and quantitative analysis,cone voltage，collision energy of EDTA disodium derivative

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 稱取魚罐頭試樣約5g（精確到0.01g）于50mL 螺旋蓋聚丙烯離心管中，加入15mL 水，再加入20mL 三氯甲烷，用均質(zhì)器以10000r·min-1均質(zhì)2min，4500r·min-1離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移至50mL 玻璃具塞離心管中。再用15mL 水重復(fù)提取兩次,合并提取液于同一50mL 玻璃具塞離心管中，待衍生化和凈化。

1.4.2 衍生化[2]

1.4.2.1 樣品溶液的衍生化 向上述提取溶液中加入1.0mL 0.02mol·L-1FeCl3溶液，混合，于超聲波中超聲20mim，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至50mL 容量瓶中，用水定容至刻度。

1.4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化 準(zhǔn)確吸取適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液于50mL 玻璃具塞離心管中，加入40mL水和1.0mL 0.02mol·L-1FeCl3鐵溶液，以下操作同1.3.2.1。

1.4.3 凈化 準(zhǔn)確移取5mL 上述衍生化樣品溶液轉(zhuǎn)移到MAX 陰離子交換柱中，控制流速在1～2 mL·min-1，棄去流出液。用5mL 水、5mL 甲醇和3mL 10%甲酸甲醇水溶液淋洗，棄去流出液。最后用6mL 10%甲酸甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液。洗脫液經(jīng)80℃氮吹儀吹干后，用5mL水溶解并定容，過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 測定方法的選擇

乙二胺四乙酸常用H4Y 表示，由于其在水及酸中的溶解度很小，常用的為其二鈉鹽：Na2H2Y2H2O，也簡寫為EDTA。當(dāng)溶液的酸度很高時，兩個羧基可再接受H+，形成H6Y2+，相當(dāng)于一個六元酸，有六級離解常數(shù)：Ka1=10-0.9、Ka2=10-1.6、Ka3=10-2.1、Ka4=10-2.8、Ka5=10-6.2、Ka6=10-10.3；7 種形式：H6Y2+、H5Y+、H4Y、H3Y-、H2Y2-、HY3-、Y4-；當(dāng)pH ＜1 時，主要以H6Y2+形式存在；當(dāng)pH 值＞11 時，主要以Y4-形式存在配位離子[15]。從中可以看出，EDTA 是極性很強化合物，如果不進行金屬離子絡(luò)合和采用離子對試劑，很難采用液相色譜法（紫外檢測器）測定其含量，國內(nèi)外的文獻報道大都基于此；Jos'e Benito Quintana 等人采用反相離子對液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定水中乙二胺四乙酸二鈉的含量[14]，使乙二胺四乙酸二鈉不進行酯化進行LC-MS/MS 測定成為可能。所以本標(biāo)準(zhǔn)最后選用UPLC-MS/MS 進行研究，經(jīng)實驗本方法的測定低限為20mg·kg-1，完全能滿足食品中乙二胺四乙酸二鈉最低限量為25mg·kg-1的要求。

2.2 衍生化試劑的確定

由于EDTA 是極性很強化合物，極容易與金屬離子絡(luò)合，形成穩(wěn)定的鰲合物。EDTA 為六齒螯合劑，可以一個分子和二價及三價金屬以1∶1 比例形成螯合物。在溶液中存在多種金屬離子時，EDTA螯合優(yōu)先與穩(wěn)定常數(shù)大的金屬離子進行反應(yīng)。螯合物穩(wěn)定常數(shù)表示EDTA 金屬螯合物的穩(wěn)定狀態(tài)，LogK（穩(wěn)定常數(shù)）越大，表示該螯合物越穩(wěn)定，越有利優(yōu)先發(fā)生螯合反應(yīng)。EDTA 螯合金屬離子穩(wěn)定性排序為Mo6+＞Bi3+＞Fe3+＞Cu2+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+＞K+＞Ca2+＞Mg2+。雖然Mo6+和Bi3+穩(wěn)定常數(shù)大，但在食品中含量是極微量的，所以用Fe3+與乙二胺四乙酸二鈉鰲合進行含量測定要比有些文獻方法采用CuCl2作為衍生化試劑要穩(wěn)定得多，其螯合物見圖1。

圖1 乙二胺四乙酸二鈉鰲合物Fig.1 Chelate of EDTA disodium

所以本方法中選擇FeCL3作為衍生化試劑進行方法檢測是可靠、可行的。

2.3 凈化方法的選擇和優(yōu)化

魚罐頭等樣品基質(zhì)，雖然進行了三氯甲烷初步的凈化，但仍然達(dá)不理想的凈化效果，色譜峰分叉比較明顯，無法進行液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析測定，詳見圖2。

圖2 未經(jīng)MAX 柱陰離子交換柱凈化的乙二胺四乙酸二鈉色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of EDTA disodium without the MAX anion exchange column purification

為此，我們選擇了固相萃取柱的凈化試驗。分別選擇HLB、C18、WAX、NH2、MAX 柱進行了固相萃取柱的凈化試驗，結(jié)果表明：HLB、C18、WAX、NH2柱的保留效果不好，起不到凈化的目的；MAX 柱保留效果和凈化效果都比較理想，但洗脫起來非常困難。如果酸度達(dá)不到一定程度，很難將乙二胺四乙酸二鈉的衍生物從MAX 柱洗脫下來。為此，我們進行了洗脫溶劑的選擇。首先，選取0.2mol·L-1三氯乙酸和甲醇，配制成5%三氯乙酸-甲醇溶液、10%三氯乙酸-甲醇溶液、20%三氯乙酸-甲醇溶液、30%三氯乙酸-甲醇溶液進行了MAX 柱的洗脫實驗，結(jié)果表明：20%三氯乙酸-甲醇溶液只用10mL 就能完全將乙二胺四乙酸二鈉的衍生物洗脫下來。但如果不吹干直接上液質(zhì)那是不行的，因為三氯乙酸的酸度太大，質(zhì)譜的峰型很差，無法進行定量分析。如果進行吹干處理，處理后樣品中仍然有酸性存在，所以就放棄了這種洗脫方式。其次，選取甲酸、水和甲醇，主要考慮甲酸是揮發(fā)性有機酸，容易吹干，配制成2%甲酸甲醇水溶液（2+50+48，V/V）、5%甲酸-水-甲醇水溶液（5+50+45，V/V）、10%甲酸-水-甲醇水溶液（10+50+40，V/V）、15%甲酸-水-甲醇水溶液（15+50+35，V/V）進行了MAX 柱的洗脫實驗，結(jié)果表明：2%甲酸甲醇水溶液和5%甲酸-水-甲醇水溶液所用的洗脫體積大約在15mL 以上，15%甲酸-水-甲醇水溶液洗脫又太快，僅需要1mL，而10%甲酸-水-甲醇水溶液所用洗脫體積在6mL 以內(nèi)，吹干后進行質(zhì)譜檢測，峰型很好，所以本凈化方法選擇了10%甲酸-水-甲醇水溶液作為洗脫溶劑，具體的洗脫曲線見圖3。

圖3 MAX 柱陰離子交換固相萃取柱洗脫曲線Fig.3 MAX eluate curve of the anion exchange solid-phase extraction column

2.4 色譜柱和流動相的選擇

據(jù)文獻報道[4，6，7]，利用液相色譜分析EDTA 螯合物常用的色譜柱為C18色譜柱，流動相通常采用四丁基氫氧化銨水溶液等離子對試劑進行分析。如果對EDTA 螯合物采用LC-MS/MS 進行分析測定，其色譜柱要有一定保留，且離子對試劑要具有很強的揮發(fā)性，通常的離子對試劑是不能使用。為此，本試驗選擇了C18（50mm×2.1mm（i.d）,1.7μm）、Phenyl（50mm×2.1 mm（i.d）,1.7μm）液相色譜柱和含有一定量三正丁胺的甲醇水溶液作為流動相進行了實驗。結(jié)果表明：C18液相色譜柱的色譜峰不尖，而且分叉；而Phenyl 液相色譜柱沒有出現(xiàn)這種情況，而且分離度和靈敏度都能滿足要求，所以本文的定量分析選擇了Pheny 液相色譜柱作為本實驗方法的色譜柱。對于流動相的選擇，我們選擇了4 種不同溶劑配比：10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）-100%甲醇、10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-80%甲醇水溶液、10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）-90%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）、10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）-95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH 3.5）。

試驗表明：10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-90%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）和10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-95%甲醇水溶液（含5 mmol 三正丁胺,pH3.5）這兩種流動相，EDTA 螯合物的出峰時間和峰形都比較理想，但10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）的靈敏度要優(yōu)于10%甲醇水溶液（含5mmol三正丁胺,pH3.5）-90%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）。所以本實驗方法的流動相選擇為10%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）-95%甲醇水溶液（含5mmol 三正丁胺,pH3.5）。

2.5 線性范圍的確定

在方法所確定的實驗條件下，取一系列不同濃度的乙二胺四乙酸二鈉的衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液，以儀器響應(yīng)峰面積對乙二胺四乙酸二鈉的衍生物的濃度進行線性回歸，結(jié)果表明:當(dāng)乙二胺四乙酸二鈉的衍生物的濃度在1.0～50.0μg·mL-1范圍內(nèi)時，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9922,回歸方程為Y=1368.57x+470.384。當(dāng)樣品中的乙二胺四乙酸二鈉的衍生物濃度超過上述兩個線性范圍時，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。

2.6 方法的測定低限、回收率和精密度

2.6.1 測定低限 測定低限是根據(jù)有關(guān)國家在魚罐頭等食品中對乙二胺四乙酸二鈉限量要求，而采用添加法進行實測的情況確定的。乙二胺四乙酸二鈉的測定低限為20mg·kg-1，其基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖、測定低限譜圖和基質(zhì)的空白譜圖參見圖4～6?？蓾M足國外限量和《基本規(guī)定》要求。

圖4 乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖（20mg·kg-1）Fig.4 MRM chromatogram of EDTA disodium derivative standard（20mg·kg-1）

圖5 魚罐頭樣品添加（20mg·kg-1）色譜圖Fig.5 Chromatogram of spiked（20mg·kg-1）in canned fish

圖6 魚罐頭樣品空白色譜圖Fig.6 Chromatogram of blank in canned fish

2.6.2 方法的回收率和精密度實驗 本方法以八寶粥罐頭為研究對象，采用添加法進行了三個水平的回收率試驗，其回收率、精密度的結(jié)果見表3。

表3 魚罐頭中乙二胺四乙酸二鈉的回收率、精密度（n=6）Tab.3 Recoveries and relative standard deviations of EDTA disodium in canned eight ingredient porridge（n=6）

由表3 可以看出，乙二胺四乙酸二鈉在20～400mg·kg-1濃度范圍之間，方法的回收率在80.75～105.40%之間，精密度均小于10%，符合殘留分析的要求。

3 結(jié)論

本文采用固相萃取技術(shù)（SPE）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)相結(jié)合的分析方法，解決了魚罐頭等樣品基質(zhì)干擾嚴(yán)重的難題，為食品中乙二胺四乙酸二鈉檢測和確證，探索了一套新穎的樣品前處理方法和色譜分析方法。該方法應(yīng)用于實際樣品檢測,效果理想。

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