• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    環(huán)境因素對溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影響

    2015-03-13 00:51:56劉文竹李紅月范學亭周永燦王世峰謝珍玉
    海南大學學報(自然科學版) 2015年4期
    關鍵詞:溶藻成膜弧菌

    劉文竹, 李紅月,范學亭,周永燦,王世峰,謝珍玉

    (海南大學 海洋學院,海南省熱帶水生生物技術重點實驗室,海南 ???570228)

    環(huán)境因素對溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影響

    劉文竹, 李紅月,范學亭,周永燦,王世峰,謝珍玉

    (海南大學 海洋學院,海南省熱帶水生生物技術重點實驗室,海南 ???570228)

    為了研究不同環(huán)境因子對溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)HN08155生物膜形成的影響,本研究采用改良的微孔板方法,結果顯示:在3個不同培養(yǎng)基中,于2216E培養(yǎng)基中生物膜形成的速度最快,與其他實驗組存在明顯差異;在pH4~9范圍內(nèi),當pH值為7.0時,溶藻弧菌形成的生物膜量最高;質(zhì)量濃度為0.5%的NaCl最適宜溶藻弧菌生物膜的生成,但NaNO3不能促進生物膜的形成;低濃度CaCl2可促進生物膜形成,MgCl2不參與溶藻弧菌生物膜的生成.由此得出結論:溶藻弧菌生物膜的形成依賴于環(huán)境條件,不同環(huán)境因子對溶藻弧菌生物膜的形成有不同的影響.

    溶藻弧菌;生物膜;環(huán)境因子

    細菌所形成的生物膜是指浮游階段生存的細菌粘附在介質(zhì)表面,通過細菌間的不斷擴增伴隨著對外分泌大分子產(chǎn)物將細菌自身包裹成有組織的結構性細菌群落[1].大量研究表明,生物膜的形成是細菌為適應不同的環(huán)境而形成的一種生存策略,也是許多病原菌難以控制的重要原因[2].細菌通過形成生物膜以抵抗不利環(huán)境,攝取營養(yǎng)物質(zhì),甚至躲避有毒有害物質(zhì).這種生存方式比浮游菌更容易在一些極端的環(huán)境下生存.Costerton等于1978年最早提出細菌生物膜的概念[3-4],由于細菌生物膜在環(huán)境適應方面具有重要的意義,因而引起了人們的廣泛重視,進而掀起了研究細菌生物膜的熱潮.細菌生物膜是由蘑菇狀或者錐狀的大量細菌組成,其含水量高達97%,這些細菌組成生物膜上的“通道”,能夠運送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等.實際上,生物膜是有著結構復雜而分工有序的菌落,包括主體生物膜層、連接層、條件層、基質(zhì)層,其結構具有不均質(zhì)性[5].

    溶藻弧菌為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一,對我國特別是南方地區(qū)的海水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的威脅[6-7].迄今為止,盡管國內(nèi)外學者對溶藻弧菌的致病機制開展了大量的研究,但對于溶藻弧菌的分子致病機理還缺乏深入了解.因此,對溶藻弧菌毒力基因和致病機理的深入研究尤為重要[9].細菌生物膜形成與否能夠明顯影響細菌侵染宿主的能力,它們在溶藻弧菌致病過程中很可能具有重要作用.

    本文通過研究不同的環(huán)境因子對溶藻弧菌HN08155所形成生物膜的影響,確定了溶藻弧菌在形成生物膜的過程中對環(huán)境因子有較強的依懶性,為今后深入研究其成膜能力和侵染機制奠定了基礎.

    1 菌種與方法

    1.1菌株及培養(yǎng)條件 本實驗室提供的溶藻弧菌HN08155分離自患病凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei), -80℃保藏.菌株接種于2216E培養(yǎng)液中,30 ℃,12 h搖床培養(yǎng),懸菌液6 000 g離心棄上清,用PBS重懸菌體沉淀,密度調(diào)至約OD600=0.5.

    1.2 試驗方法

    1.2.1 溶藻弧菌成膜的定量檢測[8]本實驗使用0.1%結晶紫染料對溶藻弧菌HN08155進行生物膜染色.取重懸菌液以1∶100比例轉接至5 mL新鮮2216E培養(yǎng)液.取200 μL培養(yǎng)液加入到無菌的96孔板中,每組12個平行樣,取新鮮的無菌2216E培養(yǎng)液為空白對照.放置30 ℃培養(yǎng)箱,靜置培養(yǎng).用250 μL PBS/孔沖洗2次,60 ℃干燥30min.加入0.1%結晶紫200 μL/孔,染色30 min,棄去染液,加入PBS 250 μL/孔清洗3次,60 ℃干燥30 min.加入200 μL/孔的95%乙醇,至于搖床將結晶紫燃料充分溶解.使用酶標儀測定OD570的值.

    1.2.2 溶藻弧菌在不同時間形成生物膜能力測定 按方法1.2.1測定成膜量,每隔12 h取樣一次.

    1.2.3 溶藻弧菌在不同培養(yǎng)基下形成生物膜能力測定 取重懸菌液以1∶100比例分別轉接至2216E、TSB和LB培養(yǎng)液中,靜置培養(yǎng)48 h,按照1.2.1的方法測細菌的成膜情況.

    1.2.4 溶藻弧菌在不同NaCl和NaNO3質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況測定

    取重懸菌液以1:100比例分別轉接至NaCl濃度為0、0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液,另取同樣重懸液以1:100比例分別轉接至NaNO3濃度為0、0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液,靜置培養(yǎng)48h,按1.2.1的方法測定細菌的成膜情況.

    1.2.5 溶藻弧菌不同初始pH條件下成膜情況測定 取重懸菌液以1∶100比例分別轉接至初始pH為4、5、6、7、8和9的1%NaCl胰蛋白酵母培養(yǎng)液,靜置培養(yǎng)48 h,按照1.2.1的方法測細菌的成膜情況.

    1.2.6 溶藻弧菌不同CaCl2和MgCl2質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況測定 取重懸菌液以1∶100比例分別轉接至CaCl2濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液,另取同樣重懸液以1∶100比例分別轉接至MgCl2濃度為0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液,靜置培養(yǎng)48 h,按1.2.1的方法測定細菌的成膜情況.

    1.3 數(shù)據(jù)處理每組實驗均設置12個平行樣,結果以平均數(shù)±標準偏差表示,利用Excel、SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析.

    2 結果與分析

    2.1 溶藻弧菌在不同時間形成生物膜能力情況在溶藻弧菌形成生物膜的初期,隨著時間的延長,OD值逐漸增加,說明生物膜的量在逐步增加,當達到72 h,OD值最高,這時生物膜的量達到最大,而后隨著培養(yǎng)時間的延長,OD值逐漸降低,生物膜的量逐漸下降(表1、圖1),各數(shù)據(jù)間存在顯著差異(p<0.05).

    2.2 溶藻弧菌在不同培養(yǎng)基下成膜情況溶藻弧菌在2216E培養(yǎng)基中,OD值最高,溶藻弧菌所形成的生物膜量最大,顯著高于其他實驗組,其次是TSB培養(yǎng)基,在LB培養(yǎng)基中形成的量最少(表2、圖2),各數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05).

    2.3 溶藻弧菌在不同NaCl和NaNO3質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況當在NaCl為0時,溶藻弧菌幾乎無法成膜,當NaCl為0.5%時,OD值達到最高,生物膜的量達到最大.當NaCl達到2%時,OD值與初始值相似,說明溶藻弧菌幾乎喪失成膜能力(表3、圖3),數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05).在僅含有NaNO3的培養(yǎng)基中,隨著濃度的增加,OD值幾乎沒有差異(表4、圖4)(p>0.05).

    表1 不同培養(yǎng)時間對溶藻弧菌生物膜形成的影響

    表2 不同培養(yǎng)基對溶藻弧菌生物膜形成的影響

    圖1 不同培養(yǎng)時間對溶藻弧菌生物膜形成的影響圖2 不同培養(yǎng)基對溶藻弧菌生物膜形成的影響

    表3 NaCl對溶藻弧菌成膜影響

    表4 NaNO3對溶藻弧菌成膜影響

    圖3 NaCl 對溶藻弧菌成膜影響圖4 NaNO3對溶藻弧菌成膜影響

    2.4 溶藻弧菌不同初始pH值條件下成膜情況當初始pH值為4、5和6時,溶藻弧菌幾乎無法形成生物膜,初始pH值為7時,OD值達到最高,溶藻弧菌生物膜形成量最大,顯著高于其他實驗組,在初始pH值為8~9時,OD值逐漸降低,生物膜量明顯減少(表5、圖5),各數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05).

    表5 初始pH值對溶藻弧菌成膜的影響

    表6 CaCl2對溶藻弧菌成膜影響

    圖5 初始pH 值對溶藻弧菌成膜的影響圖6 CaCl2對溶藻弧菌成膜影響

    2.5 溶藻弧菌不同CaCl2和MgCl2質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況當在CaCl2為0時,溶藻弧菌幾乎無法成膜,在0.5%的濃度之內(nèi),隨著CaCl2濃度的增加,OD值逐漸增高,生物膜的量逐漸增大(表6、圖6),數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(p<0.05).在僅含有MgCl2的培養(yǎng)基中,OD值幾乎沒有差異(p>0.05),無法觀察細菌生物膜的存在(表7、圖7).

    表7 MgCl2對溶藻弧菌成膜影響

    圖7 MgCl2對溶藻弧菌成膜影響

    3 討 論

    Sauer等[10-11]認為生物膜形成過程是一種動態(tài)的過程,包括菌落初始粘附、發(fā)展、成熟和老化4個階段.本文通過對生物膜的在不同時間的測定結果表明,在靜止環(huán)境中,溶藻弧菌HN08155形成的生物膜具有4個時期的變化:24~36 h為初始期,36~60 h為發(fā)展期,60~72 h為成熟期,超過72 h為衰老期.

    浮游性細菌粘附在介質(zhì)表面,這是生物膜形成的初始粘附階段.在這個階段中,細菌的粘附能力起到重要的作用,其中主要因子包括細菌的粘附素以及細菌的鞭毛.這個階段所形成的生物膜形成不穩(wěn)定,對細菌沒有形成保護結構,容易被破壞[12].在細菌粘附到介質(zhì)表面后,細菌會產(chǎn)生大量胞外產(chǎn)物,將菌落包裹起來.這些胞外產(chǎn)物將單個菌落聚起來,形成微菌落,隨著胞外產(chǎn)物不斷增加,微菌落之間逐漸連接,形成生物膜的框架.這個階段的生物對外的抗性明顯增加.伴隨著胞外產(chǎn)物的不斷增加,成熟的生物膜逐步形成.細菌生物膜根據(jù)所粘附的表面介質(zhì),生長環(huán)境,營養(yǎng)成分等的不同,會構成形態(tài)不一的生物膜結構.這種結構厚薄不一,形態(tài)各異[13-14].在這個階段的生物膜達到穩(wěn)定狀態(tài),對外界干擾的免疫力最強.在達到成熟期后,生物膜逐漸溶解,細菌脫落,形成浮游狀態(tài)從而形成新的循環(huán)過程[15].本文通過在培養(yǎng)基中測定溶藻弧菌在不同環(huán)境中所形成生物膜的差異.結果表明在含有豐富離子成分的2216E培養(yǎng)基,生物膜的量最大,在LB低離子培養(yǎng)基中,形成的生物膜最低.這說明,生物膜的形成不單單是依賴于保外多糖的量所決定的,與生存環(huán)境中離子成分和濃度也有密不可分的關系.

    根據(jù)Carli等[16]的研究表明,溶藻弧菌最適生存鹽度為1%~4%,在本實驗中,溶藻弧菌最適成膜鹽度為0.5%,在高于0.5%NaCl的濃度時,成膜能力明顯降低,達到2%NaCl濃度時,生物膜幾乎無法形成.說明溶藻弧菌在適應海水環(huán)境等自然環(huán)境中均能正常生長生物膜,鹽度過高則會影響溶藻弧菌的成膜能力.另外,本文通過NaNO3培養(yǎng)基與相同濃度NaCl培養(yǎng)基所形成生物膜對比分析,結果表明,在NaNO3培養(yǎng)基中,溶藻弧菌的生物膜幾乎不能形成,NaNO3對溶藻弧菌成膜過程無法起到促進作用.NaCl能夠促進生物膜的形成,但NaNO3不能促進其形成,這說明溶藻弧菌在形成生物膜的過程中,對鈉鹽的誘導有選擇性調(diào)控[17].

    溶藻弧菌最適生存pH值為6.0~9.0[18-19],本實驗表明,溶藻弧菌在低于pH值為6.0的酸性環(huán)境下,成膜能力受到明顯抑制,幾乎不能形成.pH值達到7.0,生物膜形成的量最大,pH值8.0~9.0,生物膜能夠形成,但形成的量明顯下降.在天然的海洋環(huán)境中,pH值偏弱堿性,當細菌處于低營養(yǎng)的環(huán)境時,弱堿性有利于溶藻弧菌粘附在介質(zhì)表面形成生物膜,間接提高溶藻弧菌抵抗外界不利因素的生存能力.

    根據(jù)Balebona等[20]研究表明,二價的陽離子能夠提高粘附細菌保外產(chǎn)物的產(chǎn)量,從而促進細菌生物膜的形成.林雅茵等[21]對銅綠假單胞菌(Pseudomnasaeruginosa)進行生物膜研究,結果表明Mg2+能夠促進生物膜的形成,推測金屬二價陽離子對多糖有穩(wěn)定作用,本文通過僅有CaCl2和MgCl2培養(yǎng)基中培養(yǎng)生物膜結果發(fā)現(xiàn),在CaCl2培養(yǎng)基中,0~0.5%濃度范圍內(nèi),隨著濃度的增高,溶藻弧菌成膜的量越大.這說明, Ca2+參與了溶藻弧菌成膜的調(diào)控過程,增強細菌與介質(zhì)表面負離子結合,形成穩(wěn)定的二價吸引力,從而提高生物膜粘附在介質(zhì)表面的穩(wěn)定性[22].在MgCl2培養(yǎng)基中,隨著MgCl2濃度的增大,OD值之間沒有差異,沒有細菌生物膜的形成.盡管二價鎂離子能夠增強細菌與表面的介質(zhì),但對溶藻弧菌而言,鎂離子無法參與成膜的過程.

    綜合實驗結果,致病性溶藻弧菌HN08155具有較強的成膜能力,其生物膜的形成與外界環(huán)境密不可分,pH、離子濃度等各種環(huán)境因素均能顯著影響其生物膜的形成.

    [1] Hall-Stoodley, Luanne, Costerton J, William, et al. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases[J]. Nature Reviews Microbiology,2004, 2(2):95-108.

    [2] Davies F, David A. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents[J]. Nature Reviews Biofilm,2003, 2(2):114-122.

    [3] Costerton , William J, Geesey G G, et al. How bacteria stick[J]. Scientific American,1987(238):86-95.

    [4] 袁海蘭, 蘇建, 胡鯤, 等. 環(huán)境因子對水霉菌生物膜形成的影響. 微生物學通報, 2014,41(9):1 829-1 836.

    [5] Ahmad A, Wiedmann A, Faust M, et al. Biofilm formation and composition on different implant materials in vivo[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2010,95(1):101-109.

    [6] 牟海津, 劉志鴻. 水產(chǎn)動物病原菌致病性胞外產(chǎn)物的研究進展.中國水產(chǎn)科學,2000,7(2):93-95.

    [7] 權太淑, 李薇, 楊喜玲.自腹瀉患者中分離溶藻性弧菌及其病原性的探討[J].中國公共衛(wèi)生, 1985,5:10.

    [8] Schmidt U,Chmel H,Cobbs C.Vibrioalginolyticusinfections in humans [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1979,10(5):666-668.

    [9] 王蓬勃, 馬悅, 劉琴, 等.溶藻弧菌鐵載體合成及外膜蛋白表達的研究[J].微生物學通報,2006,33(2):48-53.

    [10] Chen Q, Yan Q, Wang K, et al.Portal of entry forpathogenicVibrioalginolyticusinto large yellow croakerPseudosciaenacroceaand characteristic ofbacterial adhesion to mucus [J] .Biofilm, 2008,80(6):332-335.

    [11] Sauer K, Camper A K, EhrlichGarth D, et al.Pseudomonasaeruginosadisplays multiple phenotypes during development as a biofilm[J]. Journal of bacteriology,2002, 184(4):1 140-1 154.

    [12] Stoodley P, Sauer K, Davies D, et al.Biofilms ascomplex differentiated communities [J] .Annual Review of Microbiology, 2002 (56): 187-209.

    [13] Sternberg C, Christensen B B, Johansen T, et al.Distribution of bacterial growth activity in flow-chamberbiofilms[J].Applied and Environmental Microbiology, 1999,65 (9): 4 108-4 117.

    [14] 陳強, 鄢慶枇, 鄒文政, 等.環(huán)境因子對溶藻弧菌粘附大黃魚表皮粘液影響的研究[J].海洋與湖沼,2007,38(4):361-366.

    [15] O’Toole G A, Kolter R.Initiation of biofilm formation inPseudomonasfluorescensWCS365 proceeds[J] Molecular Microbiology,1998, 28 (3):449-461.

    [16] Burgemeister S, Decker E M, Weiger R,et al.Bactericidal effect of delmopinol on attached and planktonicStreptococcusSanguinisCells[J].EuropeanJournal of Oral Sciences, 2001,109 (6): 425-427.

    [17] Carli A, Pane L, Casareto L,et al.Occurrence ofVibrioalginolyticusin Ligurian coast rock pools (Tyrrhenian Sea, Italy) and its association with the CopepodTigropusfulvus(Fisher 1860)[J].Applied and Environmental Microbiolology,1993, 59(6):1 960-1 962.

    [18] Meluleni G J, Grout M, Evans D J, et al .Pseudomonasaeruginosagrowing in a biofilm in vitro are killed by opsonic antibodies to the mucoid exopolysaccharide capsule but not by antibodies produced during chronic lung infection in cystic fibrosis patients[J]. The Journal of Immunology,1995, 155(4):2 029-2 038.

    [19] Klausen M, Heydorn A, Ragas P, et al. Biofilm formation byPseudomonasaeruginosawild type, flagella and type IV pili mutants[J]. Molecular Microbiology, 2003,48(6):1 511-1 524.

    [20] Chen F R, Liu P C, Lee K K. Purification and partial characterization of a toxic serine protease produced by pathogenicVibrioalginolyticus[J].Microbios,1998,98(390):95-111.

    [21] Balebona M C, Morinigo M A, Faris A,et al.Influence of salinityand pH on the adhesion of pathogenicVibriostrainstoSparusaurata skin mucus[J].Aquaculture,1995,132(1/2):113-120.

    [22] 林雅茵,余加林,盧起,等.鎂離子對黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成過程的影響[J].中國微生態(tài)學雜志,2009,6(21):515-518.

    [23] Chen X, Stewart P S.Role of electrostatic interactions in cohesion of bacterial biofilms[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002,59(6):718-720.

    Effects of Several Environmental Factors on the Biofilm Formation ofVibrioalginolyticusHN08155

    Liu Wenzhu, Li Hongyue, Fan Xueting, Zhou Yongcan, Wang Shifeng, Xie Zhenyu

    (College of Marine Science, Hainan University, Experimental Teaching Demonstration Center of Marine Biology, Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province, Haikou 570228, China)

    In order to analyze the effects of several environmental factors on the biofilm formation ofVibrioalginolyticusstrain HN08155, in the study, the modified microtiter-plate method was performed to detect the biofilm formation under the different conditions. The results indicated that in different medium (2216E, TSB and LB), the formation of biofilm was most rapid in 2216E; from pH 4 to 9, when pH value is 7, the amounts of bacterial biofilm was the highest; 0.5% NaCl was best suitable concentration for the forming of the biofilm ofV.algionlyticus, however,NaNO3cannot promote to produce of biofilm. The conclusion can be drawn that the different environmental factors had different effects on the biofilm formation ofV.alginolyticus.

    Vibrioalginolyticus; bio-film; formation; environmental factor

    2015-05-30

    國家自然科學基金項目(No.31060360);國家科技支撐計劃項目(No.2012BAC18B04);海南省重大科技項目(No.ZDZX2013014);海南省自然科學基金項目(No.311031).

    劉文竹(1988-),女,山東青島人,海南大學海洋學字2012級碩士研究生, E-mail:243575001@qq.com

    謝珍玉(1974-),男,江西吉水人,教授, 碩士生導師,研究方向:水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖與病害控制,
    E-mail:xiezyseuta@163.com

    1004-1729(2015)04-0365-07

    S 941.42

    A DOl:10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2015.0064

    猜你喜歡
    溶藻成膜弧菌
    銷量增長200倍!“弧菌克星”風靡行業(yè),3天殺滅98%弧菌
    凹凸棒土對種衣劑成膜性能的影響
    壓水堆二回路凝汽器母管內(nèi)壁的成膜胺保養(yǎng)工藝研究
    副溶血弧菌檢測方法的研究進展
    如何有效防控對蝦養(yǎng)殖中的弧菌病
    新型鉆井液用成膜封堵劑CMF的研制及應用
    小麥內(nèi)生溶藻細菌ZB1的分離鑒定及其溶藻特性
    溶藻細菌及其溶藻活性物研究進展*
    溶藻細菌FS1的溶藻效果與機制初探
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應用
    亚洲国产欧洲综合997久久,| 天天一区二区日本电影三级| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美中文日本在线观看视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 色综合站精品国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产1区2区3区精品| 动漫黄色视频在线观看| 黄色女人牲交| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产精品av视频在线免费观看| 91av网一区二区| 久久人人精品亚洲av| 嫩草影视91久久| 两个人的视频大全免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 一个人看的www免费观看视频| av福利片在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲无线在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久99热这里只有精品18| 51午夜福利影视在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 淫妇啪啪啪对白视频| 女同久久另类99精品国产91| 美女午夜性视频免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人性生交大片免费视频hd| 91老司机精品| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲激情在线av| 亚洲黑人精品在线| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美高清成人免费视频www| 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品 欧美亚洲| 国产成人欧美在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲人成伊人成综合网2020| 女人被狂操c到高潮| 亚洲人成网站高清观看| 少妇的逼水好多| 两个人的视频大全免费| 成人特级av手机在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 三级国产精品欧美在线观看 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产视频一区二区在线看| avwww免费| 18禁美女被吸乳视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 18禁美女被吸乳视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 色在线成人网| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 最新中文字幕久久久久 | 男女午夜视频在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 中文字幕高清在线视频| 国产亚洲精品av在线| 男人舔奶头视频| 亚洲中文av在线| 国产真实乱freesex| 中文字幕久久专区| 亚洲精品一区av在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 国产视频内射| 757午夜福利合集在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 中文字幕熟女人妻在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久中文看片网| 桃红色精品国产亚洲av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美+亚洲+日韩+国产| 综合色av麻豆| 91麻豆av在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 婷婷六月久久综合丁香| 免费大片18禁| 一个人免费在线观看电影 | 很黄的视频免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩有码中文字幕| 99久久综合精品五月天人人| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久香蕉精品热| 日韩欧美国产一区二区入口| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久午夜亚洲精品久久| 91九色精品人成在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 欧美zozozo另类| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩欧美 国产精品| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成年免费大片在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 香蕉av资源在线| 久久九九热精品免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品av久久久久免费| 中出人妻视频一区二区| 欧美日韩精品网址| 一区二区三区高清视频在线| 嫩草影视91久久| 色噜噜av男人的天堂激情| 欧美性猛交黑人性爽| 丝袜人妻中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 桃红色精品国产亚洲av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 黄色日韩在线| 国产成年人精品一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 日韩欧美在线乱码| 草草在线视频免费看| 亚洲五月婷婷丁香| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产野战对白在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 看免费av毛片| 男女午夜视频在线观看| 欧美黑人巨大hd| 久久久久久久久免费视频了| 91字幕亚洲| 免费大片18禁| 国产成人av激情在线播放| 男人舔奶头视频| 欧美激情在线99| 男女那种视频在线观看| 18禁观看日本| a级毛片在线看网站| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av熟女| 久久久久国内视频| 黄色片一级片一级黄色片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产1区2区3区精品| 熟女电影av网| 无遮挡黄片免费观看| 成人特级av手机在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| h日本视频在线播放| 波多野结衣高清作品| x7x7x7水蜜桃| 激情在线观看视频在线高清| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产毛片a区久久久久| 久久中文看片网| 无人区码免费观看不卡| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久精品国产清高在天天线| 午夜激情福利司机影院| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲国产欧美人成| svipshipincom国产片| 黄色 视频免费看| 黄色视频,在线免费观看| 色av中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 我要搜黄色片| 在线免费观看不下载黄p国产 | 日韩欧美国产一区二区入口| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 美女 人体艺术 gogo| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 午夜久久久久精精品| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲午夜理论影院| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久国产成人精品二区| 日本熟妇午夜| 18禁观看日本| 亚洲精华国产精华精| 久99久视频精品免费| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品电影一区二区三区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产激情久久老熟女| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲精品色激情综合| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲七黄色美女视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 夜夜夜夜夜久久久久| 色综合婷婷激情| 国产免费男女视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 又紧又爽又黄一区二区| 国产av在哪里看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| av天堂在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 国产伦人伦偷精品视频| tocl精华| 天堂影院成人在线观看| 日本黄大片高清| 久久久国产精品麻豆| 1024手机看黄色片| 亚洲午夜理论影院| 亚洲激情在线av| 1024手机看黄色片| 国产精品一区二区精品视频观看| 深夜精品福利| 欧美丝袜亚洲另类 | 波多野结衣高清无吗| 99精品欧美一区二区三区四区| 男女视频在线观看网站免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 黄色 视频免费看| 两个人视频免费观看高清| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 成熟少妇高潮喷水视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 我要搜黄色片| 9191精品国产免费久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美成狂野欧美在线观看| 91老司机精品| 亚洲美女视频黄频| 后天国语完整版免费观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲第一电影网av| 久久精品国产综合久久久| 1000部很黄的大片| 男女视频在线观看网站免费| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久中文看片网| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲色图av天堂| 淫秽高清视频在线观看| 色av中文字幕| 美女免费视频网站| 在线观看免费午夜福利视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久香蕉国产精品| 国产综合懂色| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 岛国在线观看网站| 51午夜福利影视在线观看| 九色国产91popny在线| 大型黄色视频在线免费观看| 久久九九热精品免费| 亚洲av成人一区二区三| 国产午夜精品久久久久久| 国产单亲对白刺激| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久色成人| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲av第一区精品v没综合| 99热这里只有精品一区 | 成人18禁在线播放| 一级毛片高清免费大全| 成人特级黄色片久久久久久久| 热99在线观看视频| 美女黄网站色视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 免费av毛片视频| 亚洲av电影在线进入| 亚洲欧美日韩高清专用| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 99视频精品全部免费 在线 | 亚洲人与动物交配视频| 黄色丝袜av网址大全| 在线观看66精品国产| 国产一区在线观看成人免费| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 搞女人的毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产野战对白在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 国内精品美女久久久久久| 久久中文字幕一级| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人特级av手机在线观看| 高清在线国产一区| 欧美又色又爽又黄视频| 俺也久久电影网| 国产在线精品亚洲第一网站| 丰满的人妻完整版| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产av在哪里看| 午夜免费激情av| 久久国产精品影院| av视频在线观看入口| 韩国av一区二区三区四区| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美乱妇无乱码| 在线观看66精品国产| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产1区2区3区精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 色哟哟哟哟哟哟| 国产人伦9x9x在线观看| 后天国语完整版免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 国内精品久久久久精免费| 757午夜福利合集在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 夜夜爽天天搞| 久久热在线av| 一级毛片女人18水好多| 亚洲成人中文字幕在线播放| 美女cb高潮喷水在线观看 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 两性夫妻黄色片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 首页视频小说图片口味搜索| 国产精品99久久久久久久久| 国产不卡一卡二| 亚洲九九香蕉| 亚洲人成网站高清观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 嫩草影院精品99| 校园春色视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 不卡一级毛片| 91av网站免费观看| www.熟女人妻精品国产| av天堂在线播放| 岛国在线免费视频观看| 国产综合懂色| 亚洲国产精品999在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品电影一区二区在线| 亚洲精品美女久久av网站| 99热6这里只有精品| 九九在线视频观看精品| 国产高清激情床上av| 亚洲五月婷婷丁香| 91九色精品人成在线观看| 国产乱人视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 黑人操中国人逼视频| 村上凉子中文字幕在线| 我要搜黄色片| 国产成人av教育| 国产亚洲精品一区二区www| 国产乱人视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 色综合婷婷激情| 国产精品精品国产色婷婷| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲,欧美精品.| 成年免费大片在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 国产野战对白在线观看| a级毛片a级免费在线| 少妇的丰满在线观看| 全区人妻精品视频| 亚洲中文av在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产亚洲精品久久久久久毛片| www.999成人在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产99白浆流出| 午夜亚洲福利在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产成人系列免费观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 淫妇啪啪啪对白视频| 无遮挡黄片免费观看| 男女视频在线观看网站免费| 天堂网av新在线| 日本 av在线| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 熟女电影av网| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩中文字幕欧美一区二区| 天堂动漫精品| 午夜激情欧美在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩欧美在线二视频| 身体一侧抽搐| 露出奶头的视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费大片18禁| 久久人妻av系列| 观看美女的网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人永久免费在线观看视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 老司机午夜福利在线观看视频| 草草在线视频免费看| 亚洲avbb在线观看| 黄片小视频在线播放| 国产综合懂色| 国产一区二区激情短视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 色吧在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人啪精品午夜网站| 99久久精品一区二区三区| www日本黄色视频网| 日韩av在线大香蕉| 国产精品野战在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品欧美国产一区二区三| 中文在线观看免费www的网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 偷拍熟女少妇极品色| 免费在线观看日本一区| 日韩欧美免费精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲黑人精品在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 青草久久国产| 麻豆成人av在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 国产真人三级小视频在线观看| 制服人妻中文乱码| 免费高清视频大片| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一个人看的www免费观看视频| 老鸭窝网址在线观看| 两个人的视频大全免费| 亚洲人与动物交配视频| av欧美777| svipshipincom国产片| 九色成人免费人妻av| 99热精品在线国产| 国产一区二区在线观看日韩 | 成年人黄色毛片网站| av天堂在线播放| e午夜精品久久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天堂影院成人在线观看| 国产精品一及| 91九色精品人成在线观看| 国产精品 国内视频| 精品不卡国产一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 好男人在线观看高清免费视频| 18禁观看日本| 美女扒开内裤让男人捅视频| 精品国产美女av久久久久小说| 一区二区三区国产精品乱码| 舔av片在线| 黄色日韩在线| 久久九九热精品免费| 久久久国产欧美日韩av| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲精品色激情综合| 中文资源天堂在线| 日本a在线网址| 色哟哟哟哟哟哟| bbb黄色大片| 久久久国产欧美日韩av| www国产在线视频色| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产熟女xx| av视频在线观看入口| 亚洲成人久久性| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲片人在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产99白浆流出| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜a级毛片| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品1区2区在线观看.| 美女 人体艺术 gogo| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲在线自拍视频| 成人午夜高清在线视频| 国产高潮美女av| aaaaa片日本免费| 午夜免费观看网址| 天堂网av新在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 12—13女人毛片做爰片一| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产高清有码在线观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 又黄又粗又硬又大视频| av天堂中文字幕网| 国产午夜精品久久久久久| 精品久久久久久久久久久久久| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 免费看十八禁软件| bbb黄色大片| 久久精品人妻少妇| a在线观看视频网站| 国产1区2区3区精品| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 色尼玛亚洲综合影院| 精品久久久久久,| 色综合欧美亚洲国产小说| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 老司机午夜福利在线观看视频| av天堂在线播放| 欧美一级毛片孕妇| 精品国产三级普通话版| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲性夜色夜夜综合| 天天一区二区日本电影三级| 一进一出抽搐动态| 国产欧美日韩一区二区三| 国产1区2区3区精品| 99riav亚洲国产免费| 成人av一区二区三区在线看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久中文字幕人妻熟女| 老司机在亚洲福利影院| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 淫妇啪啪啪对白视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜精品在线福利| 亚洲乱码一区二区免费版| 日韩欧美在线二视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产毛片a区久久久久| 很黄的视频免费| 亚洲精品色激情综合| 少妇的逼水好多| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 九九热线精品视视频播放| 精品福利观看| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美在线黄色| 国产精品一区二区免费欧美| 嫩草影院精品99| 欧美日韩国产亚洲二区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 12—13女人毛片做爰片一| 久久久久精品国产欧美久久久| or卡值多少钱| 99视频精品全部免费 在线 | 免费在线观看影片大全网站| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品av视频在线免费观看|