醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中PSM-α基因檢測及相關(guān)研究

于 淼，趙自云，劉成玉，牟曉峰

（1青島大學醫(yī)學院，山東 青島 266021；2青島大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，山東 青島 266021）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcusaureus，MRSA）是臨床上引起鼻腔、口腔黏膜、皮膚和上皮組織的感染，并導致炎癥化膿的重要病原菌之一。目前，MRSA按來源分為社區(qū)獲得性 MRSA（community-acquired MRSA，CA-MRSA）和醫(yī)院獲得性 MRSA（hospitalacquired MRSA，HA-MRSA）。近年來，國內(nèi)外學者致力于MRSA毒力因子的研究，發(fā)現(xiàn)一種稱為酚溶調(diào)制肽（phenol soluble modulin，PSM）的新型毒力因子。PSM最初由Mehlin等人從表皮葡萄球菌UW-3株的培養(yǎng)液上清中分離，包括由染色體基因組編碼的 PSM-α、PSM-β、PSM-γ，以及由位于可移動遺傳元件SCCmec上的psm-mec基因編碼的PSM-mec［1］。研究［2-3］表明，CA-MRSA 菌株可以分泌PSM-α、PSM-β和PSM-γ，而 HA-MRSA菌株只能分泌PSM-β和PSM-γ，PSM-α和PSM-γ能夠溶解中性粒細胞和紅細胞等，而PSM-β則缺乏這一活性。本研究采用聚合酶鏈反應（PCR）方法檢測本地區(qū)CA-MRSA和HA-MRSA菌株中PSM-α基因的分布，并通過細胞形態(tài)學方法來觀察PSM-α對人外周血中性粒細胞的溶解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 90株不重復 MRSA菌株分離自青島大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院及周邊醫(yī)院住院和社區(qū)患者的各種標本，包括痰、血、膿液、糞便、傷口分泌物、口腔分泌物、導管、胸腔積液等。本實驗室采用多重PCR方法對菌株SCCmecc型別進行了鑒定，其中型別為 SCCmecⅢ 80 株（88.89%），SCCmecⅡ6株（6.67%），SCCmecⅤ2株（2.22%），SCCmecⅢ、SCCmecⅤ混合型2株（2.22%）。根據(jù)SCCmecⅠ、SCCmecⅡ、SCCmecⅢ型主要分布于HA-MRSA菌株中，SCCmecⅣ、SCCmecⅤ型主要分布 于 CA-MRSA 菌株中 的標準進 行 分 類［4-6］，90株MRSA菌株中 HA-MRSA86株，CA-MRSA 4株，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.1.2 主要儀器與試劑 超速低溫離心機購自德國Eppendorf公司，BIO-RAD梯度PCR儀購自美國BIO-RAD公司，BYCP-31PN電泳儀購自北京六一儀器廠，GeIX1850型凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海歐祥科學儀器有限公司，數(shù)顯恒溫水浴箱購自上海榮計達實驗儀器有限公司，普通光學顯微鏡購自日本Olympus公司，BIOWEST AGAROSE G-10購自西班牙。4%臺盼藍染液由本實驗室配制，DNA提取液、TixTap酶及PCR反應相關(guān)試劑、DL1000 DNA Marker、上樣緩沖液等試劑，均購自寶生物工程（大連）有限公司，人或各種動物外周血中性粒細胞分離液試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司。

1.1.3 引物設計與合成 根據(jù) GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計合成引物，PSM-α基因上游引物序列為:ATGGGTATCATCGCTGGCATCATTAAAGTT，下游引物序列:TTTTGCGAAAATGTCGATAATTGCTTTGAT，產(chǎn)物大小為406 bp，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA提取 將冷凍菌株轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。取50μL DNA提取液于滅菌的EP管中，用滅菌吸頭挑取單菌落，置于EP管中混勻，80℃熱變性15 min后，100℃水浴20 min，10 000 r/min離心10 min，裂解后的上清液作為PCR反應的模板。

1.2.2 擴增PSM-α基因 PCR反應體系為25μL，其中10×Buffer緩沖液2.5μL、dNTP2μL、TixTap酶0.15μL、MgCl22μL、上下游引物各1μL、DNA模板2μL、加滅菌去離子水補足25μL。反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性35 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測 PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，以DL1000 DNA Marker為相對分子質(zhì)量標準，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 DNA測序 PCR擴增陽性產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定，結(jié)果與Gen-Bank序列數(shù)據(jù)庫標準序列進行比對分析。

1.2.5 中性粒細胞死亡率檢測 按照試劑盒操作說明分離健康成人外周靜脈血（EDTA-K2抗凝）中性粒細胞，重懸培養(yǎng)液中。取4份體積均為100μL的中性粒細胞懸液，分別加入30μL的0.5麥氏單位的PSM-α陽性 MRSA菌液、0.5麥氏單位的PSM-α陰性 MRSA菌液、0.5麥氏單位的ATCC 25923菌液、生理鹽水，充分混勻，放入培養(yǎng)箱孵育3 h后，用臺盼藍染液染色并在顯微鏡下計數(shù)中性粒細胞死亡率。計算公式:死亡率（%）＝染色細胞數(shù)/（未染色細胞數(shù)＋染色細胞數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計分析 應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，將數(shù)據(jù)進行反正弦轉(zhuǎn)換后進行單因素方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MRSA菌株P(guān)SM-α攜帶情況 86株 HA-MRSA中PSM-α基因陽性78株，陽性率為90.70%；4株CA-MRSA中，2株P(guān)SM-α基因陽性，陽性率為50.00%。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 PSM-α基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis map of PCR product of PSM-α gene

2.2 基因測序結(jié)果 測序結(jié)果與GenBank序列數(shù)據(jù)庫標準序列（JQ066321.1）比對，結(jié)果完全一致。2.3 中性粒細胞死亡率 MRSAPSM-α陽性組中性粒細胞死亡率與生理鹽水組、PSM-α陰性組、ATCC25923組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.001），PSM-α陽性組死亡率高于其他3 組，而PSM-α陰性組和ATCC25923組差異，無統(tǒng)計學意義（P＝0.886），見表1。PSM-α陽性組與PSM-α陰性組對細胞的毒性結(jié)果見圖2～3。

表1 MRSAPSM-α使中性粒細胞死亡情況的比較（±s，%）Table 1 Comparison of neutrophil death induced by MRSAPSM-α（±s，%）

表1 MRSAPSM-α使中性粒細胞死亡情況的比較（±s，%）Table 1 Comparison of neutrophil death induced by MRSAPSM-α（±s，%）

Note:＊ Compared with PSM-α positive group，P＝0.001；＃:Compared with PSM-αnegative group，P＝0.886

ecimen Death rate PSM-αpositive Group Sp 50 68±12 PSM-αnegative 50 56±10＊ATCC25923 50 56±11＊＃Normal saline 50 40±10＊

圖2 MRSA PSM-α基因陽性組細胞毒性結(jié)果Figure 2 Results of cytotoxicity in PSM-αgene positive MRSA group

圖3 MRSA PSM-α基因陰性組細胞毒性結(jié)果Figure 3 Results of cytotoxicity in PSM-αgene negative MRSA group

3 討論

自2000年美國報道CA-MRSA以來，越來越多的研究者致力于其高致病力機制的研究［7］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，在鼠膿腫和菌血癥模型中PSM-α基因缺失菌株的毒力弱于野生型菌株，并證實了PSM-α能夠刺激并溶解人的中性粒細胞，最終破壞人體應對金黃色葡萄球菌感染的細胞免疫防御系統(tǒng)，認為CA-MRSA菌株的高毒力是由于其可以分泌具有溶解中性粒細胞活性的PSM-α，而HA-MRSA則不能分泌PSM-α。本研究中，86株 HA-MRSA 中PSM-α基因陽性78株，陽性率為90.70%，這與國外研究［2-3，8］的結(jié)果不同，可能因為國內(nèi)臨床治療中抗菌藥物的濫用，導致HA-MRSA菌株毒力增強，但具體原因有待進一步研究。本研究檢測到的CA-MRSA菌株過少，無法進行HA-MRSA和CA-MRSA菌株中PSM-α陽性率差異的統(tǒng)計學分析。

中性粒細胞是機體免疫防御系統(tǒng)的第一道防線，通過吞噬作用識別并攝取病原體，隨后產(chǎn)生活性氧或脫顆粒作用殺傷病原體，起到局部控制感染的作用［9］。分泌PSM-α的MRSA菌株被中性粒細胞吞噬后，PSM-α可以促進中性粒細胞的胞內(nèi)溶解，延緩細胞凋亡，使病原菌大量存活，最終逃脫中性粒細胞的殺傷作用，導致疾病的發(fā)生［10-11］，但 PSM-β不能在這一過程中發(fā)揮作用［12］。

為進一步了解本地區(qū)分離的HA-MRSA所分泌的PSM-α是否也具有促進中性粒細胞溶解的活性，本研究比較PSM-α基因陽性菌株和陰性菌株對人中性粒細胞的影響，結(jié)果表明分泌PSM-α的MRSA對中性粒細胞的溶解作用高于不分泌PSM-α的MRSA，而不分泌PSM-α的MRSA與ATCC25923的溶解作用無差異。

綜上所述，本研究有助于我們進一步了解MRSA菌株能夠逃脫中性粒細胞殺傷作用的機制，為臨床尋找治療MRSA感染的新途徑及金黃色葡萄球菌疫苗的制備提供了理論依據(jù)。

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