基因工程技術(shù)在楊樹抗逆境方面的研究進展

主楚杰　王愛云

摘要：闡述了基因工程技術(shù)在楊樹抗逆遺傳改良方面的應(yīng)用，總結(jié)了轉(zhuǎn)基因楊樹抗病蟲、抗旱、耐鹽以及在環(huán)境修復中取得的研究成果，討論了基因工程技術(shù)在楊樹抗逆方面存在的問題。楊樹因長速快、產(chǎn)量高、基因組小等特點，具有較高的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益，同時也是林木遺傳改良的模式樹種。盡管對楊樹抗逆遺傳改良進行了相關(guān)研究，但有關(guān)外源基因提高楊樹抗逆性的機理和應(yīng)用仍有待進一步深入研究。挖掘新的抗逆基因、培育具有抗性的楊樹新品種仍將是今后的研究重點。

關(guān)鍵詞：基因工程；楊樹；抗逆

中圖分類號：S792.110.4 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0010-04

收稿日期：2014-10-16

基金項目：湖南省自然科學基金（編號：13JJ5024）。

作者簡介：主楚杰（1990—），男，湖南長沙人，碩士研究生，主要從事植物遺傳改良研究。E-mail：zhuchujie@163.com。

通信作者：王愛云，教授，主要從事植物遺傳改良研究。E-mail：wangaiyun12@aliyun.com。楊樹是重要的速生豐產(chǎn)工業(yè)用材、綠化建設(shè)、防護林和生物質(zhì)能源樹種之一，具有較高的經(jīng)濟價值和生態(tài)效益。楊樹的基因組較小，基因組測序已完成，因此，楊樹被作為模式林木樹種應(yīng)用于木材的形成、抗逆性遺傳改良等方面的研究[1]。20世紀末至21世紀初，我國建造了超過1 000萬hm2的速生林基地，楊樹占重要部分。隨著楊樹人工林的大面積推廣，楊樹的抗逆性明顯降低，病蟲害的發(fā)生和危害逐漸加重，培育楊樹抗病新品種迫在眉睫。由于楊樹生長周期長、樹體高大，采用傳統(tǒng)育種方法在短時間內(nèi)培育抗病新品種較困難。隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展，植物抗逆機理研究的深入以及某些抗逆相關(guān)基因的克隆和轉(zhuǎn)化，為楊樹抗逆遺傳改良開辟了一條新途徑[2-3]。

1轉(zhuǎn)基因楊樹抗病蟲研究

1.1抗病研究

1.1.1抗病毒病抗病毒基因工程研究在林業(yè)上的應(yīng)用才剛起步，目前，使用的基因主要有洋李痘病毒的外殼蛋白基因和黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因等幾種。Cooper、李瑋等分別將花葉病毒外殼蛋白基因和抗菌肽LCI基因?qū)霔顦渲校@得良好抗病效果的轉(zhuǎn)基因植株[4-5]。

1.1.2抗細菌病農(nóng)桿菌感染楊樹后，楊樹極易感染冠癭病。目前，關(guān)于楊樹抗冠癭病的研究主要是采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將農(nóng)桿菌致瘤基因、激素IAA基因、抗菌肽基因（兔防御素NP-Ⅰ基因）導入楊樹，獲得抗性提高的轉(zhuǎn)基因植株[6]。

1.1.3抗真菌病植物受到病原物侵染后，會使多種病程相關(guān)蛋白迅速表達，參與其抗病防衛(wèi)反應(yīng)。在這些病程相關(guān)蛋白中，最主要的蛋白之一就是幾丁質(zhì)酶 [7]，幾乎所有的植物器官中均可以發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶[8]。在正常情況下，幾丁質(zhì)酶水平很低，但經(jīng)誘導因子的誘導，表達量可以迅速增加。病原真菌、細菌、病毒的侵染、激發(fā)子和一些逆境等均可能誘導植物幾丁質(zhì)酶的表達[9]。近年來，有關(guān)對植物幾丁質(zhì)酶的特性、基因結(jié)構(gòu)、分類、分子進化、生物學作用及轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的研究，已成為植物抗真菌病害的研究熱點之一[10-11]。1991年，Broglie等首次對轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因在植物的抗真菌病方面進行了研究，他們將菜豆幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入煙草和油菜，并得到表達，有效降低了植株的死苗率，控制了病情的發(fā)展[12]。但轉(zhuǎn)基因煙草植株對病原真菌的抗性沒有明顯提高。進一步研究證明，幾丁質(zhì)酶同工酶類型及其在植物體內(nèi)定位的不同，將影響基因的表達和植株的抗病性。

Nicolescud等分別將矮牽牛黃酮合成酶基因、草酸氧化酶基因、幾丁質(zhì)酶基因?qū)霔顦洌@得了具有一定抗性的轉(zhuǎn)基因植株[13-15]。王瓊等以受落葉松-楊柵銹菌單孢子堆菌系Sb052侵染的川楊葉片為材料，采用RACE技術(shù)克隆川楊幾丁質(zhì)酶基因DNA全長，通過熒光定量表達分析，推測PsChi I基因參與了寄主川楊抵抗真菌的防御機制[16]。

1.2抗蟲研究

食葉害蟲和蛀干害蟲是危害楊樹的2類主要害蟲，包括楊尺蠖、舞毒娥、楊扇舟蛾、光肩星天牛、桑天牛、云斑天牛等。目前，國內(nèi)外用于楊樹抗蟲基因工程研究的外源基因主要有蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因、抗菌肽基因、昆蟲特異性神經(jīng)蝎毒素基因、幾丁質(zhì)酶基因、多酚氧化酶、脂氧化酶、膽固醇氧化酶，以及Vip3A等，但對于楊樹轉(zhuǎn)Bt基因的研究最為深入，發(fā)展也最為迅速[17-19]。

1.2.1蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因從蘇云金桿菌的芽孢中分離出來的Bt殺蟲晶體蛋白，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)60多種，一般用Cry1、Cry2、Cry3、Cry4和Crt來表示，劃分的主要依據(jù)是由其殺蟲譜范圍和基因序列的同源性來決定[20]。Bt毒蛋白是一個單基因產(chǎn)物，1981年Schnepf等首次將蘇云金桿菌Kurstaki HD-1的Bt毒蛋白基因克隆[21]。該基因的mDNA在植物中表達量較低，不穩(wěn)定，同時也不會改變原氨基酸序列，從而使這些毒蛋白的基因表達量提高了上百倍[22-23]。鑒于Bt毒蛋白具有高度專一性、生物降解性，且對人畜無害的安全性，被作為轉(zhuǎn)基因植物抗蟲基因工程中理想的殺蟲目的基因[24]。目前，已有許多轉(zhuǎn)Bt基因植物問世，有的已進入大田試驗和商品生產(chǎn)階段[25]。國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因在楊樹方面的研究，主要集中在歐洲黑楊、美洲黑楊、歐美楊和楊樹雜種NC5339（Populusdehoides alba×P. grandidentata）、NL-80106 （P.×P. simonii）、741楊[P. alba × （P. davidiana+P. simonii） ×P. tomentosa]等品種上，這些轉(zhuǎn)Bt基因楊樹均具有一定的抗蟲效果[26]。最早見于報道的是用Bt CryIA基因轉(zhuǎn)化歐洲黑楊，通過Southern雜交證明外源基因的成功轉(zhuǎn)入[27]。此后，抗蟲轉(zhuǎn)基因研究就拉開了帷幕。廣大研究工作者圍繞Bt基因[28-33]，以及Bt嵌合基因[34-35]、Bt雙元表達載體[36]、Bt雙價抗蟲基因[37-38]在楊樹中的抗蟲性進行了廣泛研究，并取得了明顯的抗蟲效果。

1.2.2蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑是對蛋白水解酶有抑制活性的一種水分子蛋白質(zhì)，普遍存在于植物、動物和微生物中[39]。迄今為止，自然界共發(fā)現(xiàn)四大類蛋白抑制劑：絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑和酸性蛋白酶抑制劑。目前，用于轉(zhuǎn)化楊樹的主要有絲氨酸蛋白酶抑制劑基因和半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因[40]。McNabb等首次將馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因?qū)隢C5339無性系，轉(zhuǎn)化獲得抗蟲楊樹[41]。Klopfenstein等分別利用馬鈴薯的蛋白酶抑制劑與NPT，以及大豆絲氨酸蛋白酶抑制劑基因、水稻巰基蛋白抑制劑基因和Bt Cry（A）構(gòu)成的嵌合基因?qū)霔顦?，獲得轉(zhuǎn)基因植株[42-43]。郝貴霞等將廣譜抗蟲基因豇豆胰蛋白酶抑制劑基因成功地導入了毛白楊，經(jīng)PCR和PCR-Southern檢測證實基因已整合進楊樹基因組中[44]。

1.2.3昆蟲毒性基因昆蟲特異性神經(jīng)毒素是從胡蜂、蝎子、蜘蛛的毒液中分離到的一些小肽（30～40個氨基酸），是一類作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)并具有毒殺作用的蛋白類神經(jīng)毒素。這類毒素只作用于昆蟲而對哺乳動物和其他動物無害或者毒性很小，是一種十分理想的抗蟲基因源[45]。伍寧豐等將抗蟲的蝎神經(jīng)毒素基因?qū)牒跅顭o性系N-80106中，通過根癌農(nóng)桿菌將構(gòu)建在雙子葉高效表達載體上的已優(yōu)化了密碼子的AaIT基因轉(zhuǎn)化楊樹雜種NL-80106（Populusdeltoides×P. sinonii），得到了轉(zhuǎn)基因植株[46]，通過PCR、PCR-Southern雜交和ELISA分析，證實了轉(zhuǎn)基因植株中AaIT基因的表達，轉(zhuǎn)基因植株對1齡舞毒蛾幼蟲的效果最好，具有明顯抗蟲性。

1.2.4其他抗蟲基因近年來，陸續(xù)開展了植物凝集素基因、脂氧化酶、多酚氧化酶、膽固醇氧化酶及Vip3A等編碼基因在楊樹抗蟲方面的應(yīng)用研究，取得了一定的進展[47-48]。

2轉(zhuǎn)基因楊樹耐旱研究

我國國土面積有50%以上屬于干旱或半干旱地區(qū)，這些地區(qū)降雨量集中，年降水量介于250～500 mm之間，土壤水分缺失嚴重。據(jù)統(tǒng)計，半干旱區(qū)人工造林成活率、保存率大約為30%，而干旱區(qū)一般為4%，最高也不會超過20%，嚴重阻礙了當?shù)亓謽I(yè)生產(chǎn)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善[49]。

根據(jù)基因的作用方式，可將參與楊樹干旱脅迫相關(guān)基因分為2類：一類是直接參與植物抗旱能力提高的功能基因，包括水通道蛋白、滲透蛋白、Lea蛋白等；一類是起調(diào)節(jié)作用的蛋白基因，主要包括Bzip、MYC、MYB和DREB等傳遞信號和調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子基因。MAP激酶、CDP激酶、受體蛋白激酶、核糖體蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶等，以及感應(yīng)和轉(zhuǎn)導脅迫信號的蛋白激酶基因以及磷酸酯酶、磷酸酶C等蛋白酶基因[50]。目前，關(guān)于楊樹抗旱研究主要通過克隆松樹、檉柳、樺樹、櫟樹等極端抗逆植物的抗旱基因，導入楊樹中，獲得抗旱性植株。

侯德英等采用根癌農(nóng)桿菌介導法，將甜菜堿合成酶基因轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株[51]。通過農(nóng)桿菌介導法，王沛雅等分別將油菜素內(nèi)酯生物合成酶基因DAS5、檉柳TabZIP基因、鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄基因、pBI121-chlAPX重組質(zhì)粒等基因?qū)霔顦渲校D(zhuǎn)基因株系的抗旱性得到提高[52-55]。經(jīng)過不斷研究，轉(zhuǎn)sosl基因山哈楊[56]、轉(zhuǎn)Lea基因小黑楊[57]、轉(zhuǎn)AtDREB1A基因銀新楊[58]、轉(zhuǎn)AREB1C基因南林895楊[59]、轉(zhuǎn)Trx基因歐美楊[60]、轉(zhuǎn)基因SacB銀腺雜種楊[61-62] 等的抗旱性均有不同程度的提高。崔旭東等采用基因槍法，5個抗旱相關(guān)基因——轉(zhuǎn)錄因子基因JERF36基因、ZxZF基因、AREB基因和功能基因SacB基因、GST基因的共轉(zhuǎn)化，獲得了包含1～4個外源基因的轉(zhuǎn)基因抗旱性楊樹植株[63]。

3轉(zhuǎn)基因楊樹耐鹽研究

隨著全球人口不斷增長，工農(nóng)業(yè)污染日益加重，淡水資源急劇減少，土壤鹽堿化帶來的危害越來越明顯，嚴重制約著我國農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，影響生態(tài)環(huán)境平衡，阻礙經(jīng)濟發(fā)展。因此，提高植物的耐鹽性、加強鹽堿土的生物治理和綜合開發(fā)具有重要實際意義。鹽脅迫對楊樹的生長影響較大，主要影響楊樹的生長、光合作用、生物膜、物質(zhì)代謝和激素的產(chǎn)生等。楊樹的耐鹽機理主要與滲透調(diào)節(jié)機制、離子區(qū)域化機制與楊樹耐鹽相關(guān)基因（糖醇合成相關(guān)基因、甜菜堿合成相關(guān)基因以及脫水應(yīng)答元件DREB類基因）的調(diào)節(jié)相關(guān)[64-66]。

圍繞楊樹耐鹽機理，在抗鹽基因工程中主要有以下轉(zhuǎn)化基因進行了應(yīng)用研究：1-磷酸甘露醇脫氫酶、甜菜堿醛脫氫酶、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因、反義磷脂酶D、6-磷酸山梨醇脫氫酶等。其中Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白和液泡H+焦磷酸化酶是當前植物耐鹽研究的焦點，這2種蛋白在植物的抗鹽過程中起重要的作用。美國已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的楊樹，耐鹽效果較好[67]。我國在耐鹽轉(zhuǎn)基因楊樹的研究取得了良好進展。1-磷酸甘露醇脫氫酶基因、外源基因BetA、山菠菜AhDERB1基因、雙價耐鹽基因（甘露醇和山梨醇基因）、番茄的ERF類轉(zhuǎn)錄因子JERFs基因、mt1D基因[68-74]、遼寧堿蓬的外源基因、NTHK1的轉(zhuǎn)基因、Mn-SOD基因、蒙古柳cDNA農(nóng)桿菌表達文庫、重組質(zhì)粒pBI121-cAPX、擬南芥Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白（Na+/H+antiporter）基因（AtNHX1）、正義 PLDα基因[75-81]等外源基因成功導入楊樹中，并取得了不同程度的耐鹽轉(zhuǎn)基因植株。

4轉(zhuǎn)基因楊樹在環(huán)境修復方面的研究

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，土壤污染日益嚴重，重金屬已成為土壤污染中最嚴重的污染物之一。采用具有重金屬超富集能力的植物對該類土壤進行綜合治理是最安全、最經(jīng)濟有效的環(huán)境治理方法。但重金屬超富集植物生長緩慢、生物量低，而生長速度快、生物量高的林木材料對重金屬富集量低。通過基因工程技術(shù)在楊樹遺傳改良上的應(yīng)用，開展了關(guān)于利用楊樹修復重金屬污染土壤的一系列研究，并取得了一定進展。

1998年，Rugh等將抗重金屬相關(guān)基因merA轉(zhuǎn)入到楊樹中，研究表明，轉(zhuǎn)基因楊樹對汞的富集能力是未轉(zhuǎn)基因楊樹的10倍，而對重金屬汞的耐受性也提高了3～4倍[82]。轉(zhuǎn)基因植株的基因產(chǎn)物也能有選擇地影響某些土壤微生物的生長與繁殖，但與施肥、灌水和施藥等農(nóng)作措施相比，影響明顯較小[83]。

5存在問題及展望

經(jīng)過廣大研究者的不斷努力和探索，利用基因工程技術(shù)提高楊樹的抗逆性取得了一些成果，但仍存在不足。楊樹在分子水平上的定向改造技術(shù)遠遠落后于農(nóng)作物，楊樹的內(nèi)源優(yōu)良抗性基因還未被識別和有效利用。能夠有效利用于楊樹的外源基因多來自于農(nóng)作物，多數(shù)是只能控制單一性狀的功能基因，這些基因的轉(zhuǎn)入并不能完全滿足楊樹多基因調(diào)控的要求，現(xiàn)階段外源基因?qū)霔顦涞霓D(zhuǎn)化效率低、試驗重復性差。如何將外源基因定位整合入楊樹基因組中且能在高代轉(zhuǎn)基因材料中穩(wěn)定表達，挖掘楊樹本身優(yōu)良抗逆基因，實現(xiàn)多基因共轉(zhuǎn)化等方面，還有待進一步深入研究。

利用基因工程技術(shù)，對林木進行定向遺傳改良提高抗逆性，為培育林木新品種提供了一條新途徑。楊樹具有生長速度快、生物量高、基因組小等特點，在林木分子遺傳育種中有著不可替代的作用。我國的荒地、鹽堿地、沙土地、重金屬污染地面積大，培育多抗性的速生、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)楊樹品種，為這些地區(qū)提供適應(yīng)的楊樹品種，不僅可以改善生態(tài)環(huán)境，同時也可以促進地方經(jīng)濟的持續(xù)發(fā)展。

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