抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌內(nèi)生細(xì)菌KLXD06粗蛋白的提取

摘要：雪膽具有多種藥用價(jià)值，菌株KLXD06是從雪膽中分離篩選的1株對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）具有抗菌活性的內(nèi)生細(xì)菌。采用硫酸銨鹽沉淀法提取KLXD06產(chǎn)生的抑菌粗蛋白，結(jié)果表明，用硫酸銨鹽沉淀法能提取KLXD06發(fā)酵液的抑菌粗蛋白，抑菌粗蛋白對(duì)MRSA的抗性較強(qiáng)，并具有一定的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：雪膽；內(nèi)生細(xì)菌；耐甲氧西林金色葡萄球菌；抑菌粗蛋白；提?。豢咕?；熱穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0334-02

收稿日期：2014-03-28

基金項(xiàng)目：樂(lè)山師范學(xué)院科研項(xiàng)目（編號(hào)：Z1160）。

作者簡(jiǎn)介：唐梅（1971—），女，重慶人，碩士，副教授，主要從事微生物分子生物學(xué)研究。E-mail：764301686@qq.com。

通信作者：龔明福，博士，教授，主要從事微生物資源及微生物與植物間相互關(guān)系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是醫(yī)院內(nèi)感染率極高的多重耐藥性病原菌[1-2]，僅對(duì)萬(wàn)古霉素敏感[3]，醫(yī)源性MRSA感染性疾病與乙型肝炎（HBV）、艾滋?。ˋIDS）并列為世界范圍內(nèi)三大最難解決的感染性疾病[4]。我國(guó)對(duì)藥用植物抗金黃色葡萄球菌等感染進(jìn)行過(guò)一系列研究[5]，但是針對(duì)MRSA的研究較少，近幾年MRSA才得到關(guān)注[6]。

雪膽（Hemsleya sinesis Cogn.） 為葫蘆科雪膽屬植物，不但對(duì)多種病原菌具有抗菌作用[7]，還有多種藥理功效[8-10]，因而應(yīng)用廣泛[11]。生活在雪膽組織中的內(nèi)生細(xì)菌能產(chǎn)生與雪膽相似的活性成分。筆者課題組從雪膽中分離篩選到多株具有抗MRSA活性的內(nèi)生細(xì)菌菌株[12]，其中菌株KLXD06抗MRSA活性極強(qiáng)。本研究采用硫酸銨沉淀法提取KLXD06發(fā)酵液中的粗蛋白，并檢測(cè)其對(duì)MRSA的抑菌活性，旨在為進(jìn)一步開展雪膽內(nèi)生細(xì)菌抗菌活性物質(zhì)成分和功能研究以及抗MRSA新藥研制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌株

KLXD06為筆者課題組分離保存的具有抗MRSA活性的雪膽內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)常規(guī)鑒定為芽孢桿菌（Bacillus sp.）。MRSA由峨眉山特色生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2KLXD06抑菌蛋白提取及抑菌活性測(cè)定

1.2.1KLXD06抑菌蛋白的提取將活化的KLXD06按接種量7%接入無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨酵母培養(yǎng)基（BPY）：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉5 g、葡萄糖5 g、蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2。37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)3～4 d，4 000 r/min離心15 min后棄沉淀，上清液經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器（Φ=0.22 μm）過(guò)濾，將濾液緩慢地加入飽和硫酸銨溶液至飽和度達(dá)到60%左右放置過(guò)夜，12 000 r/min 離心10 min，棄上清液。用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值為6.8）溶解沉淀，溶解液置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抑菌粗蛋白對(duì)MRSA的活性測(cè)定在直徑為9 cm的NA平板中涂布接種0.1 mL活化好的MRSA病原細(xì)菌菌懸液，在平板上等距離打4個(gè)直徑為6 mm的孔洞，用已滅菌的100 μL移液槍向其中加入濃度分別為20%、60%、100%的粗蛋白溶解液100 μL。每個(gè)處理加入等量無(wú)菌水作為對(duì)照，37 ℃ 黑暗培養(yǎng)1～3 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。用“十”字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.3抑菌粗蛋白熱穩(wěn)定性測(cè)定取拮抗效果明顯的1組粗提蛋白溶解液，分別在40、60、80、100 ℃水浴處理15 min和121 ℃加熱處理30 min后，按上述方法測(cè)定其對(duì)病原菌MRSA的抑菌圈直徑。以未經(jīng)熱處理的原液代替處理液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。用粗蛋白的剩余抑菌活性表示抑菌粗蛋白的熱穩(wěn)定性。

剩余抑菌活性=（處理液產(chǎn)生的抑菌圈直徑/未處理原液產(chǎn)生的抑菌圈直徑）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1KLXD06抑菌粗蛋白對(duì)MRSA的抗菌活性

對(duì)經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀法得到的抑菌粗蛋白溶解液進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)。由表1可見，KLXD06抑菌粗蛋白對(duì)MRSA的抑菌活性明顯，100% KLXD06粗蛋白提取液對(duì)MRSA的拮抗效果較為明顯，在0.05水平上與20%、60%KLXD06粗蛋白的抑菌效果有顯著差異。該處理下平均抑菌圈直徑達(dá)到 13.7 mm，具有作為抗MRSA藥物開發(fā)的潛力。

2.2KLXD06抑菌粗蛋白的熱穩(wěn)定性

由圖1可見，KLXD06菌株產(chǎn)生的抑菌粗蛋白在40、60、80、100 ℃水浴處理15 min和121 ℃加熱處理30 min后，仍保持一定的抑菌活性。40、60 ℃處理15 min后，剩余抑菌活性與對(duì)照保持一致，仍然保持100%的抑菌活性；80、100 ℃處理15 min后，剩余抑菌活性分別降為75.0%、63.0%；121 ℃處理30 min后，剩余抑菌活性仍保留35.5%。表明KLXD06抑菌粗蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性，可耐受121 ℃及以下的溫度。

3結(jié)論與討論

測(cè)定不同濃度雪膽內(nèi)生細(xì)菌KLXD06抑菌粗蛋白對(duì)致病微生物MRSA的抑菌活性，結(jié)果表明KLXD06能分泌產(chǎn)生具有較高抗菌活性的產(chǎn)物。目前我國(guó)主要從黃岑、黃連等中草藥及其提取物中篩選抗MRSA的物質(zhì)[13-15]，但中草藥成分復(fù)雜，其抑菌機(jī)制較難分析。劉佳等從土壤細(xì)菌中篩選到1株對(duì)MRSA有較好抑菌活性的芽孢桿菌[16]；黃惠琴等從海洋微生物中篩選到1株抗MRSA的海洋放線菌[17]；張守村等從苦豆子內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株抗MRSA活性較強(qiáng)的菌株，并提取到1種抗MRSA的活性成分[18]。從其他藥用植物內(nèi)生細(xì)菌中篩選抗MRSA菌株的研究還鮮見報(bào)道，對(duì)內(nèi)生細(xì)菌抗MRSA成分的分析更少。endprint

KLXD06產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)可以通過(guò)硫酸銨鹽析沉淀法分離得到，并對(duì)熱穩(wěn)定，本研究初步認(rèn)定其抗菌活性物質(zhì)的主要成分為蛋白類物質(zhì)，但究竟是什么物質(zhì)，結(jié)構(gòu)及性質(zhì)如何，是否存在其他抑菌物質(zhì)，抑菌物質(zhì)產(chǎn)生條件等問(wèn)題還有待深入探討。

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