硫源對高溫厭氧產(chǎn)氫菌Caldicellulosiruptor changbaicum發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

于雷等

摘要：以從長白山溫泉中篩選到的高溫厭氧產(chǎn)氫菌Caldicellulosiruptor changbaicum為菌種，研究硫源對其發(fā)酵纖維素產(chǎn)氫的影響。先以Na2S、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3為硫源進行單因素試驗，考察硫源對菌株生長和產(chǎn)氫的影響。然后在生物反應(yīng)器中分別以Na2S和Na2S、Na2S2O3混合物為硫源進行厭氧發(fā)酵試驗。結(jié)果在以Na2S ∶Na2S2O3=1 ∶2的混合物為產(chǎn)氫菌提供硫元素時，發(fā)酵液pH值呈穩(wěn)定下降趨勢，產(chǎn)氣穩(wěn)定時的平均速率為90～100 mL/（L·h），氫氣的轉(zhuǎn)化效率達到7.73 mmol/g VS，說明Na2S、Na2S2O3混合硫源有利于該高溫厭氧菌發(fā)酵纖維素產(chǎn)氫。

關(guān)鍵詞：高溫厭氧產(chǎn)氫菌；Caldicellulosiruptor changbaicum；纖維素；硫源；氫氣；生物反應(yīng)器；發(fā)酵產(chǎn)氫

中圖分類號： TQ920.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0326-03

收稿日期：2014-03-20

基金項目：吉林省科技發(fā)展規(guī)劃項目（編號：20100563）。

作者簡介：于雷（1973—），男，吉林長春人，博士，副教授，研究方向為食品科學與發(fā)酵工程。E-mail：leiyujl@sina.com。進入21世紀以來，從石油、煤炭等礦產(chǎn)資源開采量的不斷上升以及儲存量的不斷減小，到人們對可替代能源的追求與探索，能源問題已經(jīng)成為了全世界共同關(guān)注的焦點問題[1]。氫氣作為一種可燃的氣體，有著諸多方面的優(yōu)點。例如環(huán)保，氫氣燃燒后的產(chǎn)物除了水之外沒有其他任何物質(zhì)，是絕對無污染的；另外，氫氣的燃燒值最高，達到了3 042 cals/m3，且燃燒的熱轉(zhuǎn)化效率也很高。因此，關(guān)于制氫技術(shù)的研究成為了近年來人們關(guān)注的熱點[2]。

在所有的制氫技術(shù)中，生物制氫以其反應(yīng)條件溫和、節(jié)能、可再生，還可以治理工業(yè)污染等諸多優(yōu)點，逐漸成為了研究的熱門領(lǐng)域[3]。生物制氫主要分為兩大類，一類為光合微生物發(fā)酵；另一類為厭氧微生物發(fā)酵。其中，厭氧微生物發(fā)酵生物質(zhì)制氫具有治理污染、環(huán)保和高產(chǎn)能等特點，有著非常廣闊的開發(fā)前景，越來越多的厭氧產(chǎn)氫菌已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用到富含纖維素污染物的處理當中[4]。高溫厭氧微生物在所有發(fā)酵產(chǎn)氫的厭氧微生物中，由于其發(fā)酵環(huán)境的溫度較高，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氣體不需要再經(jīng)過后繼操作就可以快速溢出，因此在一定程度上降低了生產(chǎn)成本。而且氫氣的快速溢出，也減小了氫氣對發(fā)酵過程的抑制作用，從另一角度提升了發(fā)酵制氫的速率[5]。相對于其他厭氧產(chǎn)氫菌，高溫菌更易得到高的產(chǎn)氫效率[6-7]，理論最大產(chǎn)氫量可以達到每消耗1 mol/L菌葡萄糖產(chǎn)4 mol/L H2[8]，因此利用高溫厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)氫具有較大的生產(chǎn)潛力。

在利用高溫厭氧產(chǎn)氫菌制氫的過程，影響其生長和產(chǎn)氫的因素很多[9]，如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)所利用碳源、氮源的種類和金屬離子的影響等等。除上述因素以外，硫源對該類細菌的生長和制氫有著非常大的影響，該類細菌的生理生化特性表明硫元素為新陳代謝過程中的電子受體，因此硫元素是該類細菌生長所必須的元素之一[10-11]。本試驗主要研究硫源對分離自長白山溫泉的高溫厭氧產(chǎn)氫菌Caldicellulosiruptor changbaicum的生長以及產(chǎn)氫的影響，從而為其發(fā)酵產(chǎn)氫的應(yīng)用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌種及來源

高溫厭氧產(chǎn)氫菌由吉林大學分子酶學教育部重點實驗室提供，通過16S rRNA全序列比對及系統(tǒng)發(fā)育學分析，發(fā)現(xiàn)這株菌屬于熱解纖維素果汁桿菌屬，命名為Caldicellulosiruptor changbaicum。

1.2培養(yǎng)基

傳代培養(yǎng)基：0.33 g NH4Cl，0.33 g KH2PO4，0.33 g KCl，0.33 g MgCl2·6H2O，0.20 g CaCl2，1.0 mL 金屬離子，10.0 mL 維生素，1.5 g NaHCO3，0.5 g Na2S·9H2O，0.5 g刃天青，0.5 g酵母粉，5.0 g濾紙，1 000 mL去離子水。滅菌條件：115 ℃，20 min。其中金屬離子、維生素、NaHCO3、Na2S·9H2O、刃天青和濾紙單獨滅菌，在傳代時再分別加入；濾紙用組織搗碎機搗碎后再滅菌后利用。

金屬離子的配制：10.00 mL HCl（25%），1.5 g FeCl2·4H2O，70.00 mg ZnCl2，10.00 mg MgCl2·4H2O，6.00 g H3BO3，190.00 mg CoCl2·6H2O，2.00 mg CuCl2·H2O，24 mg NiCl2·6H2O，36 g NaMoO4，990 mL 去離子水。

維生素的配制：2.00 mg 維生素H，2.00 mg維生素B9，10.00 mg維生素B6，5.00 mg維生素B1-HCl·2H2O，5.00 mg 維生素B2，5.00 mg煙酸，5.00 mg泛酸鹽，0.10 mg維生素B12，5.00 mg對氨基苯甲酸，5.00 mg ZnSO4，1 000.00 mL 去離子水。

發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基與傳代培養(yǎng)基除硫源不相同以外，其他成分均相同。

1.3硫源單因素試驗

利用250 mL的厭氧瓶進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的體積為 200 mL，接種量為3%，利用N2、CO2體積比為4 ∶1的混合氣來提供厭氧環(huán)境，（75±1） ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)。

試驗分別利用含相同硫元素濃度的Na2S、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3來提供硫環(huán)境，并以不加任何硫元素的培養(yǎng)基為對照，來研究高溫厭氧菌的生長及產(chǎn)氫的現(xiàn)象。

1.4生物反應(yīng)器發(fā)酵endprint

如圖1所示，利用2.0 L的生物反應(yīng)器進行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗，發(fā)酵培養(yǎng)基的體積為1.7 L，接種量為12%[12]，利用連接75 ℃循環(huán)水浴的皮管套控制發(fā)酵溫度，利用磁力攪拌器對發(fā)酵液進行攪拌，轉(zhuǎn)速為300 r/min；培養(yǎng)基的碳源為0.5%的濾紙。通過“1.3”的試驗結(jié)果可以得到發(fā)酵產(chǎn)氫最佳的硫化合物或者混合物，然后以它們?yōu)榱蛟催M行發(fā)酵試驗，從而確定最佳的硫源。

1.5分析方法

發(fā)酵液中還原糖利用DNS法測定[13]；發(fā)酵產(chǎn)生的氣體（H2、CO2、CH4等）利用氣相色譜法測定[14]，具體條件：用的柱子為3 m Hayesep Q 色譜柱，并利用熱導(dǎo)檢測器。進樣針和柱子的溫度分別為110、130 ℃。

2結(jié)果與分析

2.1高溫厭氧菌對硫源的選擇性

在相同的試驗條件下分別利用不同硫源對高溫菌進行培養(yǎng)，結(jié)果如表1所示。

試驗結(jié)果表明，對于高溫厭氧產(chǎn)氫菌Cal. changbaicum來說，硫是該類細菌正常生長所必需的元素，在硫元素缺乏的條件下，細菌不能生長。由表1可見，Na2S和Na2S2O3是硫元素的最佳提供者，細菌長勢良好。因此，在后面的生物反應(yīng)器發(fā)酵試驗中，就以這2種化合物為發(fā)酵培養(yǎng)基提供硫元素。

但是在利用Na2S2O3為單一的硫源、培養(yǎng)基排氧時間與添加其他硫元素的培養(yǎng)基相同時，培養(yǎng)基的顏色為紅色，說明培養(yǎng)基中含有氧氣，厭氧菌無法生長。如果繼續(xù)使用Na2S2O3為硫源，那么對培養(yǎng)基進行排氧處理的時間就要相應(yīng)地加長，一般排氧時間會在1 h左右，因此從排氧時間角度考慮，單獨利用Na2S2O3硫源不十分理想。而當培養(yǎng)基中添加Na2S時，排氧的時間只需要5 min左右，可見Na2S可以起到快速去除培養(yǎng)基中痕氧的作用。因此，在下面的反應(yīng)器發(fā)酵過程中，分別選擇Na2S和Na2S、Na2S2O3的混合物作為硫源進行對比發(fā)酵試驗。

2.2生物反應(yīng)器發(fā)酵過程中硫源的選擇

2.2.1以Na2S為硫源發(fā)酵產(chǎn)氫以Na2S為唯一的硫源，利用0.5%濾紙為碳源進行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗，發(fā)酵過程中產(chǎn)氣速率與發(fā)酵液pH值的變化如圖2所示。

由圖2可知，當以濾紙作碳源、Na2S為唯一的硫源時，厭氧菌一直沒有得到很好的發(fā)酵效果，產(chǎn)氣速率一直維持在 15 mL/（L·h） 左右，發(fā)酵產(chǎn)生的氣體總量只有1 200 mL左右。

在發(fā)酵的前3 h，有大量的氣體溢出，經(jīng)測定其中大部分為H2S，進而使得培養(yǎng)基的硫元素大量溢出，致使硫元素缺失，從而導(dǎo)致該菌無法正常生長。

另外，大量的H2S溢出也導(dǎo)致了在發(fā)酵的起始階段發(fā)酵液的pH值由7.0左右快速升高到8.4。雖然之后發(fā)酵液的pH值有所下降，但也都在7.6以上，而該菌最適pH值在 6.5～7.5 之間，使得該菌在偏堿性的pH條件下不能夠快速生長并產(chǎn)氣。

目前國外高溫厭氧菌發(fā)酵產(chǎn)氫的研究中，培養(yǎng)基硫源大多是直接由Na2S來提供的，其他硫化合物基本上都沒有用到。筆者所在課題組在試驗過程中發(fā)現(xiàn)單獨使用Na2S作為培養(yǎng)基的硫源并沒有得到較好的產(chǎn)氫效果。

2.2.2以Na2S和Na2S2O3的混合物為硫源發(fā)酵產(chǎn)氫由“2.2.1”的試驗結(jié)果可知，硫環(huán)境對發(fā)酵產(chǎn)氫起著非常重要的作用，單獨使用Na2S提供硫環(huán)境時，并沒有得到比較好的試驗結(jié)果，因此將試驗改為以Na2S和Na2S2O3的混合物來提供硫環(huán)境。

Na2S和Na2S2O3的添加的方法為在對培養(yǎng)基進行排氧的同時緩慢添加Na2S，直到培養(yǎng)基的顏色變?yōu)闊o色后，培養(yǎng)基所必需的剩余的硫元素再由Na2S2O3提供，按照硫含量的比例得出Na2S ∶Na2S2O3為1 ∶2。

如圖3所示，在以Na2S和Na2S2O3的混合物為硫源后，雖然在發(fā)酵前的5 h仍然有大量的H2S溢出，發(fā)酵液的pH值也有所升高，但由于此次利用的硫源為Na2S和Na2S2O3的混合物，細菌表現(xiàn)出仍然可以正常生長并產(chǎn)氣，因此在發(fā)酵進行5 h后，產(chǎn)氣速率又開始緩慢上升，發(fā)酵15 h左右產(chǎn)氣速率開始逐漸趨向穩(wěn)定，一直到33 h左右產(chǎn)氣速率仍一直維持在 90 mL/（L·h） 左右。

此次發(fā)酵共產(chǎn)生了3 253 mL的氣體，經(jīng)測定，氫氣的含量在40%左右，由此發(fā)酵共產(chǎn)生了58 mmol H2；得到的氫氣的轉(zhuǎn)化率達到了7.73 mmol/g VS，與Carver等試驗中利用的高溫厭氧產(chǎn)氫菌的轉(zhuǎn)化率相當[15]，達到了較高的轉(zhuǎn)化率，從而表明高溫厭氧菌Cal. changbaicum具有廣闊的應(yīng)用前景。可見，在利用Na2S和Na2S2O3混合物作為硫源時，既可以快速排除培養(yǎng)基中的氧氣，減小培養(yǎng)基中的痕氧對細菌生長產(chǎn)生的不利影響，同時還可以保證培養(yǎng)基中有效的硫環(huán)境，實現(xiàn)高溫厭氧產(chǎn)氫菌的正常生長和產(chǎn)氫。

3結(jié)論

試驗結(jié)果表明，在高溫厭氧菌Cal. changbaicum的生長環(huán)境中沒有硫元素的存在時，細菌無法正常生長，說明硫元素是此類細菌的生長過程中的必需元素之一。高溫厭氧菌對硫源存在著一定的選擇性，通過厭氧瓶培養(yǎng)得到生長和產(chǎn)氫的最佳硫源為Na2S和Na2S2O3 2種化合物。當以Na2S和Na2S2O3混合物作為硫源在生物反應(yīng)器中發(fā)酵時，氫氣的轉(zhuǎn)化效率高達7.73 mmol/g VS，這說明混合的硫源對高溫厭氧產(chǎn)氫菌發(fā)酵纖維素產(chǎn)氫具有明顯影響，從而為該菌的進一步利用提供了良好的理論和技術(shù)依據(jù)。

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