深黃被孢霉發(fā)酵對(duì)大豆油脂含量及成分的影響

摘要：以粉碎的大豆為發(fā)酵底物，用深黃被孢霉進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，通過檢測(cè)發(fā)酵過程中菌絲的形態(tài)、提油量的變化和油脂成分，以探尋有助于提高大豆出油總量的方法。研究結(jié)果表明，深黃被孢霉在以大豆為發(fā)酵底物的條件下，能觀察到菌絲中有油脂的積累，并且大豆在經(jīng)深黃被孢霉發(fā)酵144 h后油脂提取量最大，在提取時(shí)間3 h的情況下，油脂提取率達(dá)到了89.39%，與相同培養(yǎng)、提油條件下沒有經(jīng)過微生物發(fā)酵的油脂比較，提取量提高了31.79%，經(jīng)過深黃被孢霉發(fā)酵后的大豆油脂多不飽和脂肪酸含量比未經(jīng)過發(fā)酵的大豆油增加了9%。

關(guān)鍵詞：大豆；深黃被孢霉；液態(tài)發(fā)酵；油脂提取率；脂肪酸成分

中圖分類號(hào)： TS225.1+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0269-02

收稿日期：2014-11-05

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金（編號(hào)：黔科合J字[2011]32號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：牛曉娟（1983—），女，黑龍江大慶人，碩士，講師，主要從事應(yīng)用微生物的研究。Tel：（0851）6702541；E-mail：252984899@qq.com。

通信作者：邱樹毅，博士，教授，主要從事應(yīng)用微生物、化學(xué)工程、食品工程的研究。E-mail：syqiu@gzu.edu.cn。油料作物的常規(guī)提油方法主要是機(jī)械壓榨和有機(jī)溶劑浸出法，不能有效地分解細(xì)胞壁和破壞油脂蛋白質(zhì)體，導(dǎo)致提油后餅粕中殘留較多的油脂，油脂提油率不高。研究表明，在提取的過程中加入能夠破壞細(xì)胞壁和油脂體的酶[1-2]，將有助于在較短的時(shí)間里提高油料種子的提油率。Shah等采用三相分離的方法應(yīng)用于麻瘋樹籽油脂的提取，在三相分離提取前用一種叫做Protizyme的混合酶進(jìn)行預(yù)處理，在超聲波振動(dòng)下僅僅2 h，出油率就達(dá)到98%[3]。Sharma等將含酸性、中性、堿性蛋白酶的混合酶加入到花生種籽中，在設(shè)定條件下保溫18 h，花生油提取率達(dá)到了92%[4]。本研究利用產(chǎn)油微生物可能產(chǎn)生的酶類代替現(xiàn)成的工業(yè)酶制劑的部分作用（破壞細(xì)胞壁或者分解蛋白質(zhì)、糖類等），不僅可以使油料作物本身出油率提高，產(chǎn)油微生物還可以利用油料作物本身的碳水化合物產(chǎn)生微生物油脂，兩者油脂累加可提高出油率，把生物發(fā)酵法更好地應(yīng)用于油脂提取，可以大大節(jié)省油脂提取的成本。

1材料與方法

1.1材料

大豆購自貴陽市煤礦村市場(chǎng)。

1.2菌種

深黃被孢霉（Mortierella isabellina，AS 3.3410），購自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，使用前先進(jìn)行活化。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1菌種保藏培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸取液 1.0 L，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1微量，瓊脂15.0 g，pH值6.0，1×105 Pa滅菌30 min。

1.3.2種子培養(yǎng)基深黃被孢霉種子培養(yǎng)液：馬鈴薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH 值6.0。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基大豆發(fā)酵培養(yǎng)基：粉碎過的大豆10 g，自來水100 mL，pH值自然。

1.4試驗(yàn)方法

挑取保存于斜面的少量菌絲，于PDA斜面培養(yǎng)基上 28 ℃ 培養(yǎng)3 d，直至長(zhǎng)出大量孢子。用無菌水沖洗斜面上的孢子，并用移液槍吸取500 μL接入100 mL的液體種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。然后將種子液按1%的比例接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，三角瓶裝液量均為100 mL，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)144 h。每隔24 h取樣進(jìn)行油脂提取。

1.4.1粗脂肪的測(cè)定以乙醚作溶劑，采用索氏提取的方法對(duì)烘干過的樣品進(jìn)行油脂提取，一般認(rèn)為索氏提取8 h可以把樣品中的油脂提取完全[5]，即為油料作物的總脂肪含量。本試驗(yàn)把培養(yǎng)條件相同但未接種深黃被孢霉、油脂提取時(shí)間為3 h作為對(duì)照。

計(jì)算公式：

粗脂肪含量=m2-m1m×100%。

式中：m1為抽提瓶質(zhì)量（g），m2為索氏抽提后抽提瓶和油脂總質(zhì)量（g），m為樣品的質(zhì)量（g）。

1.4.2脂肪酸成分分析日本島津GC-2014型氣相色譜儀配以FID檢測(cè)器和聚乙二醇（PEG）毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.53 mm×0.53 μm）。氣體流量：以高純氮作為載氣，F(xiàn)ID檢測(cè)器的氫氣和空氣流量比為50 ∶50 kPa，流速為 1.5 mL/min；柱溫：180 ℃ 保溫2 min后，以5 ℃/min升溫至 230 ℃，在230 ℃ 保持15 min；溫度條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為20 ∶1；對(duì)照脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，對(duì)經(jīng)接種深黃被孢霉、接種黑曲霉和未接種微生物處理提取的大豆油分別進(jìn)行脂肪酸成分的測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1菌絲形態(tài)

接種深黃被孢霉的大豆發(fā)酵液在培養(yǎng)120 h后，培養(yǎng)液中肉眼可見乳白色的菌絲球，直徑如小米粒大小。取樣在光學(xué)顯微鏡放大100倍條件下觀察（圖1），可以看到有黃色油滴狀微生物存在，在光學(xué)顯微鏡放大1 000倍的情況下（圖2）觀察，可以看到深黃被孢霉的菌絲形態(tài)。表明深黃被孢霉能夠以大豆為發(fā)酵底物進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，并積累油脂。

2.2油脂提取量

經(jīng)索氏提取8 h后的大豆（沒有經(jīng)過發(fā)酵處理）提油量為23.00%（m/m）（即試驗(yàn)用大豆的總油脂含量為23.00%）；經(jīng)索氏提取3 h后的大豆（沒有經(jīng)過發(fā)酵處理）提油量為156%（m/m）（即對(duì)照組提油量為15.60%）。從圖3可以看出，接種深黃被孢霉的大豆在發(fā)酵后144 h，油脂提取時(shí)間3 h時(shí)達(dá)到最大提油量，為20.56%，油脂提取率達(dá)89.39%，比對(duì)照組提高了31.79%。表明深黃被孢霉對(duì)提高大豆提油率發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用。endprint

2.3不同處理大豆油脂的主體成分檢測(cè)

接種深黃被孢霉的大豆脂肪酸中亞油酸、亞麻酸、花生烯酸3種多不飽和脂肪酸的含量占總脂肪酸含量的72.06%，未經(jīng)過發(fā)酵提取的大豆油中3種多不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸含量的66.10%，為了進(jìn)一步證明深黃被孢霉在以大豆為發(fā)酵底物產(chǎn)生了微生物油脂，我們對(duì)能提高大豆油脂提取率的另1株微生物黑曲霉在相同培養(yǎng)條件以及提油條件下做了脂肪酸成分分析（表1），分析結(jié)果表明脂肪酸成分與未發(fā)酵的相比變化不大。

3結(jié)論

產(chǎn)油微生物可以利用大豆本身的碳水化合物產(chǎn)出多元不飽和脂肪酸豐富的微生物油脂，再加上大豆本身提取的油脂，兩者油脂累加從而提高了大豆的出油率。多不飽和脂肪酸具有特殊的生物學(xué)功能，采用深黃被孢霉發(fā)酵會(huì)使大豆油脂中多不飽和脂肪酸含量的增加。

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