新疆昌吉地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟免疫抗體水平檢測(cè)與分析

李澤宇

（新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 昌吉831100）

豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。目前，該病主要在亞洲、非洲、南美洲和歐洲等44 個(gè)國(guó)家流行。豬瘟在我國(guó)曾廣泛流行，20 世紀(jì)50 年代使用豬瘟兔化弱毒苗后得到一定控制。但近20年來(lái)，非典型性豬瘟發(fā)病增多，仔豬發(fā)病也趨多見(jiàn)，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的危害非常大。近年來(lái)昌吉養(yǎng)豬業(yè)得到了飛速發(fā)展，2013年全年出欄生豬242.5萬(wàn)頭，而對(duì)于豬瘟的防治，多用疫苗免疫，但是由于養(yǎng)殖水平參差不齊、免疫程序不規(guī)范，該病在新疆時(shí)有發(fā)生。為了掌握昌吉地區(qū)規(guī)模化豬場(chǎng)豬瘟免疫抗體水平的高低及消長(zhǎng)規(guī)律，同時(shí)為養(yǎng)殖戶(hù)提供一個(gè)科學(xué)合理的免疫程序，本試驗(yàn)選擇昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

武漢科前動(dòng)物生物制品公司生產(chǎn)的豬瘟病毒ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒、實(shí)驗(yàn)室提供自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek儀器有限公司），微量移液器（eppendorf公司），恒溫培養(yǎng)箱（北京市光明醫(yī)療儀器廠(chǎng)），無(wú)菌操作臺(tái)，振蕩器，滅菌高壓鍋，高速離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備。

2 實(shí)驗(yàn)樣品

2.1 血清樣品的準(zhǔn)備

血清：由新疆昌吉地區(qū)A、B、C、D、E5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)（種母豬﹥300頭）共采集血清數(shù)共1350份，采集公豬血清共50份、后備母豬共200份、哺乳母豬共100份、妊娠母豬100份、7日齡仔豬150份、14日齡仔豬150份、21日齡仔豬150份、30日齡仔豬30150份、40日齡仔豬150份、55日齡仔豬150份。

2.2 樣品采集時(shí)間、方法及樣品儲(chǔ)存

血清共分4次均等采集，分別為2012年7月、2012年10月、2013年1月、2013年4月；主要采集方法為前腔靜脈采血法（對(duì)與成年豬只個(gè)別采取耳緣靜脈采血），血液采集后用高速離心機(jī)提取血清即樣品，置于－20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

3 試驗(yàn)方法與判定

3.1 血清稀釋

3.1.1 樣品 按照1∶40的體積在血清稀釋板進(jìn)行稀釋。

3.1.2 對(duì)照 按照1∶40的體積分別將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照稀釋?zhuān)瑢?duì)樣品和對(duì)照，稀釋相同的倍數(shù)。

3.2 試驗(yàn)方法步驟

3.2.1 加樣 取抗原包被板，將稀釋好的樣品血清和對(duì)照血清分別按照100μL 對(duì)應(yīng)從稀釋板轉(zhuǎn)入抗原包被板中，待檢樣品每份加一個(gè)孔，對(duì)照樣品每份加2個(gè)孔，在振蕩器上微微振勻孔中的樣品，然后置37 ℃溫育30min。

3.2.2 洗滌 洗板甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μL，靜置3 min倒掉，再在吸水紙上拍干，共計(jì)洗滌5次。

3.2.3 加酶 每孔加羊抗豬酶標(biāo)二抗100μL，置37 ℃再溫育30min。

3.2.4 洗滌 同2。

3.2.5 顯色 每個(gè)孔分別加入底物A 和B（50 μL）混勻，室溫避光顯色10min。

3.2.6 檢測(cè) 終止反應(yīng)加終止液50μL 利用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

3.3 結(jié)果判定

在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的OD630nm值。試驗(yàn)成功的條件是陽(yáng)性對(duì)照孔的平均OD630nm值均≥0.8，陰性對(duì)照孔的平均OD－630nm值均＜0.3。

樣品OD630nm值≥0.35，為陽(yáng)性；樣品OD630nm值＜0.35，為陰性。

表1 CSF血清抗體ELISA 檢測(cè)與HIA 的轉(zhuǎn)換

4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用EXCEL 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理，用SPSS11.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

5 結(jié)果與分析

5.1 各豬場(chǎng)CSF血清抗體水平分析

從表格可以看出（表2）：通過(guò)對(duì)昌吉地區(qū)5 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)共1350份血清的檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性總數(shù)為1 081，陽(yáng)性率為80.07%，平均OD 值為1.121，標(biāo)準(zhǔn)差為0.856，其中A、B、C、D、E5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)陽(yáng)性率分別為92.2%、82.59%、74.44%、88.51%、62.59%、80.07%，各個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)之間陽(yáng)性率差異均為極顯著（P＜0.01），其中A 場(chǎng)和D 場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05），B 場(chǎng)和D 場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05），其他之間差異均為顯著（P＜0.05）。

表2 昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)各場(chǎng)CSF血清抗體水平及陽(yáng)性率匯總表

通過(guò)統(tǒng)計(jì)可知，A、B、C、D、E 各場(chǎng)的OD 值分別1.215、0.901、1.115、1.254、0.904、總體OD 值為1.121，其中A 場(chǎng)和D 場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05），B場(chǎng)和D 場(chǎng)差異不顯著（P＞0.05），其他之間差異均為顯著（P＜0.05）。

圖2 昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)各場(chǎng)CSF血清抗體平均OD 值

5.2 各豬場(chǎng)CSF不同血清抗體效價(jià)水平分析

從表格（表3）可以看出：抗體效價(jià)＜5log2血清數(shù)共269 份，占總血清數(shù)的19.93%，抗體效價(jià)為5log2血清數(shù)共97份，占總血清數(shù)的7.2%，抗體效價(jià)為6log2血清數(shù)共169份，占總血清數(shù)的12.5%，抗體效價(jià)為7log2 血清共289 份，占總血清數(shù)的21.4%，抗體效價(jià)≥8log2血清數(shù)共526份，占總血清數(shù)的38.97%。

表3 不同抗體效價(jià)的樣本數(shù)及所占比率統(tǒng)計(jì)表

圖3 不同抗體效價(jià)的樣本數(shù)及所占比率統(tǒng)計(jì)表

5.3 不同階段豬群CSF血清抗體水平分析

從表格（表4）可以看出：公豬、后備母豬、哺乳母豬、妊娠母豬、7日齡仔豬、14日齡仔豬、21日齡仔豬、30日齡仔豬、40日齡仔豬、55日齡仔豬抗體陽(yáng)性率分別為92%、69%、86%、93%、72%、82%、88.67%、80.67%、72.66、82.67%，通過(guò)統(tǒng)計(jì)可知各階段的豬群抗體陽(yáng)性率差異很大，陽(yáng)性率最高為妊娠母豬和公豬，抗體陽(yáng)性率最低為后備母豬和40日齡仔豬。從仔豬陽(yáng)性率結(jié)果可以看出，仔豬在7日齡豬瘟抗體陽(yáng)性率最低為72%，從7 日齡到21 日齡在逐漸升高，21日齡抗體陽(yáng)性率最高為88.67%，30日齡抗體陽(yáng)性率降到最低為72.66%。

表4 昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)不同階段豬群CSF血清抗體水平及陽(yáng)性率匯總表

圖4 昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)不同階段豬群血清抗體陽(yáng)性率

圖5 昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)不同階段豬群血清抗體平均OD 值

6 討論

6.1 各豬場(chǎng)總體檢測(cè)結(jié)果分析

從結(jié)果分析可知，昌吉地區(qū)5個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)共1350份血清，陽(yáng)性總數(shù)為1081，該地區(qū)的總體陽(yáng)性率為80.07%，平均OD 值為1.121。與國(guó)家規(guī)定的70%水平對(duì)比相對(duì)較高，血清的整體效價(jià)較好，本次結(jié)果與馬曉艷等2012年對(duì)新疆地區(qū)的豬瘟抗體合格率為75.3%結(jié)果相近，本次結(jié)果顯示豬瘟抗體陽(yáng)性率比張繼紅等2009利用豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)對(duì)新疆地區(qū)12個(gè)地（州、市）采集的1749份血清樣品總體免疫合格率為71.3% 較高。劉建營(yíng)等（2012）對(duì)廣東地區(qū)2012年豬瘟抗體水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示廣東地區(qū)豬瘟抗體陽(yáng)性率為76.5%，程漢等（2012）對(duì)江蘇泰州地區(qū)的豬瘟抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽(yáng)性率為79.3%。但是部分豬場(chǎng)豬瘟抗體陽(yáng)性率低于70%，這與豬場(chǎng)防疫管理有不可推卸的責(zé)任，應(yīng)加強(qiáng)豬瘟的免疫抗體水平監(jiān)測(cè)。

6.2 不同階段仔豬CSF血清抗體陽(yáng)性率水平分析

圖6 不同階段仔豬的CSF血清抗體水平分析

從圖9可以看出：從仔豬陽(yáng)性率結(jié)果可以看出，仔豬在7日齡豬瘟抗體陽(yáng)性率最低為72%，從7日齡到21日齡在逐漸升高，21日齡抗體陽(yáng)性率最高為88.67%，30 日齡抗體陽(yáng)性率降到最低為72.66%。這與曹建等（2012）用HIA 法對(duì)仔豬母源抗體效價(jià)檢測(cè)的結(jié)果15～21日齡達(dá)到最高值，21日齡后逐步降低，于35日齡達(dá)到抗體保護(hù)臨界值基本相符。結(jié)合臨床可知，哺乳初期抗體陽(yáng)性率有所上升，與母乳中充足的母源抗體有直接關(guān)系，但隨著日齡增大，仔豬抗體陽(yáng)性率降低，斷奶后抗體陽(yáng)性率急劇降低，因?yàn)槟冈纯贵w攝入不足引起。經(jīng)過(guò)第一次免疫，仔豬豬瘟抗體陽(yáng)性率在35～50 日齡開(kāi)始回升。因此在仔豬母源抗體攝入不足時(shí)及時(shí)進(jìn)行免疫接種非常必要。

7 小結(jié)

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，昌吉地區(qū)豬瘟免疫后保護(hù)力目前比較穩(wěn)定，達(dá)到了國(guó)家規(guī)定要求的免疫保護(hù)率70%，但是有個(gè)別豬場(chǎng)免疫效果不理想，這與不健全的防疫制度有很大的關(guān)系。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查可知：昌吉地區(qū)豬瘟首免日齡多數(shù)在30d左右，二免日齡在60d左右。部分豬場(chǎng)進(jìn)行超前免疫，并于50日齡進(jìn)行二免。

結(jié)合對(duì)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)昌吉地區(qū)豬瘟免疫程序提出以下建議：

7.1 把好疫苗質(zhì)量關(guān)

7.1.1 做好疫苗運(yùn)輸保管工作，保證其生物學(xué)效價(jià)。運(yùn)輸途中用冰塊包裝以保證低溫，疫苗稀釋后在15 ℃以下6h 內(nèi)用完，在15～27 ℃應(yīng)于3h 內(nèi)用完，超時(shí)棄用并銷(xiāo)毀。

7.1.2 堅(jiān)持免疫消毒，確保注射有效。針具消毒，一豬一針頭，避免交叉感染；針頭長(zhǎng)度適中，方法得當(dāng)，以利于刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。

7.1.3 禁止使用過(guò)期、無(wú)標(biāo)簽、失效稀釋后不溶解及時(shí)間較長(zhǎng)的疫苗，確保豬只使用合格的疫苗，以產(chǎn)生足夠的抗體、增強(qiáng)免疫力。

7.2 適時(shí)接種

7.2.1 后備公、母豬使用前進(jìn)行兩次豬瘟免疫接種，間隔一個(gè)月。

7.2.2 生產(chǎn)公、母豬每年春秋兩秋各普免一次。

7.2.3 經(jīng)產(chǎn)母豬每次斷奶前跟胎免疫一次。

7.2.4 仔豬23～25日齡進(jìn)行首免疫，60日齡時(shí)進(jìn)行第二次免疫，為提升免疫水平，可以進(jìn)行多次免疫。

7.3 定期進(jìn)行豬瘟免疫抗體監(jiān)測(cè)

定期進(jìn)行豬瘟免疫抗體監(jiān)測(cè)，可了解豬瘟疫苗的免疫效果及豬瘟抗體水平，以估測(cè)豬群合適的免疫時(shí)間，對(duì)制定免疫程序有重要意義。

［1］ 王琴.國(guó)內(nèi)外豬瘟現(xiàn)狀及研究進(jìn)展［M］.農(nóng)業(yè)部中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所國(guó)家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室，北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版，2003：48－56.

［2］ 許追，齊向濤，齊亞銀，等.新疆石河子地區(qū)豬瘟免疫抗體水平檢測(cè)與分析［J］.養(yǎng)豬，2013（5）：97－99.

［3］ 臺(tái)凡力，李佳.廣東湛江市規(guī)?；i場(chǎng)豬瘟免疫抗體水平檢測(cè)分析［J］.養(yǎng)豬，2014（3）：94－96.

［4］ 朱建軍，馮升，毛曉麗，等.五家渠市規(guī)模豬場(chǎng)豬瘟免疫抗體水平檢測(cè)分析［J］.養(yǎng)豬，2013（6）：123－124.

［5］ 付少剛，馬建春，曹曉真，等.豬瘟免疫抗體水平監(jiān)測(cè)及免疫效果評(píng)估分析［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011（5）：38－40.

［6］ 鄒麗，周雪，徐登峰.豬瘟免疫抗體水平的監(jiān)測(cè)［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2013（7）：94.

［7］ Ruggli N，Tratschin JD，Mittelholzer C，et al.Nucleotide sequence of classical swine fever virus strainAlfort／187 and transcription of infectious RNA from stably cloned fμLl－length cDNA ［J］.J Virol，1996，70：3478－3487.

［8］ 王在時(shí)，丘惠深，郎洪武.豬瘟病毒野外分離物的研究.中國(guó)獸藥監(jiān)察所研究報(bào)告匯編第14 輯，北京：1999，35－38.

［9］ 劉湘濤，韓雪清，劉伯華，等.豬瘟流行野毒Erns基因的序列分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，33（4）：75－81.

［10］ Fritzemeier J，Ritzemeier J，Teuffert JI，et al.Epidemiology of classical swine fever in Germany in thenineties［J］.Vet Microbiol，2000，77（1－2）：29－41.

［11］ 杜念興.豬瘟的回顧與展望.中國(guó)畜禽傳染?。跩］.1998（5）：317－319.

［12］ 韓雪清，劉湘濤，趙啟祖.豬瘟病毒及其豬瘟疫苗研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2000，21（2）：1－7.

［13］ 涂長(zhǎng)春.豬瘟國(guó)際流行態(tài)勢(shì)、我國(guó)現(xiàn)狀及防制對(duì)策［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003 36（8）：955－960.

［14］ 呂宗吉，涂長(zhǎng)春，余興龍，等.我國(guó)豬瘟的流行病學(xué)現(xiàn)狀分 析［J］.中 國(guó) 預(yù) 防 獸 醫(yī) 學(xué) 報(bào)，2001，23（4）：300－302.