肌動(dòng)蛋白重構(gòu)蛋白對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和分化的影響＊

賈小麗，高 鋒，官菊梅

（1.四川中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院皮膚科，四川綿陽(yáng)621000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都610075）

瘢痕是創(chuàng)傷修復(fù)的必然結(jié)果，組織的異常修復(fù)可形成病理性瘢痕，不但影響美容，且常有瘙癢、刺痛等癥狀[1]，但其發(fā)病機(jī)制至今仍是醫(yī)學(xué)需突破的難題。有研究顯示，病理性瘢痕與成纖維細(xì)胞密不可分，細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積與真皮成纖維細(xì)胞的異常增殖被認(rèn)為是病理性瘢痕的兩大特點(diǎn)[2]；肌動(dòng)蛋白重構(gòu)蛋白（flightlessⅠ，F(xiàn)liⅠ）是創(chuàng)傷愈合一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，可以抑制細(xì)胞的增殖和移動(dòng)[3]，尤其對(duì)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的作用明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，采用小分子RNA片段干擾和FliⅠ表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)研究FliⅠ對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2012年1月至2014年1月于四川中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的12例住院患者的增生性瘢痕組織，年齡18～46歲，男女不限?；颊甙l(fā)病時(shí)間均大于半年，突出于皮膚并發(fā)紅，質(zhì)硬，高出正常皮面1cm左右，病變部超過(guò)原損傷創(chuàng)面，局部皮膚無(wú)感染和潰瘍；皮膚損傷局部感染、皮膚腫瘤、高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)性疾病則排除取材[4]。取材部位無(wú)破損、感染，取材前未行特殊治療，患者均已知情同意并簽署了知情同意書(shū)[5]。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（蘭州民海）；0.5%Ⅰ型膠原酶（Biosharp公司）；EDTA螯合劑（杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司）；WST-1（美國(guó)Sigma公司）；Lipofectamine 2000（美國(guó)卡爾斯巴德英杰公司）；FliⅠsiRNA（靶序列為5′-GCU GGA ACA CUU GUC UGU GTT-3′，廣州復(fù)能基因公司）；COL-1引物（上游序列5′-CCA GTG TCC ATG TCG CAG A-3′，下游序列5′-TGA GCC AGC AGA TTG AGA AC-3′）；兔多克隆抗膠原（Gilbertsville，PA）；鼠單克隆抗FliⅠ抗體（CA，USA）；ECL Plus Western blot檢測(cè)系統(tǒng)（GE Healthcare公司，美國(guó)）；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒）；Opti-MEMⅠ減血清培養(yǎng)基、TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）。

1.3 儀器 CP124S電子分析天平（Sartorius）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；酶標(biāo)定量測(cè)定儀（Thermo Multiskan AsCant公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司）；超聲破碎儀Uibra-cel（SONICS）；Image Pro-Plus program（Media Cybernetics Inc，Maryland，USA）；PCR凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Transillmination公司）；灰度分析軟件（美國(guó)公立衛(wèi)生研究院）；Gene Amp PCR System 9700基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司）。

1.4 人瘢痕成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將標(biāo)本在無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)PBS沖洗2～3次，剝離表皮及皮下脂肪組織，保留中間瘢痕組織，在含少量DMEM培養(yǎng)基的玻瓶中將瘢痕剪成1mm2碎塊，加入10mL的0.5%Ⅰ型膠原酶消化，置于37℃孵箱消化3～4h，分離表皮和真皮，以PBS沖洗2～3次，Ⅰ型膠原酶再次消化1h，期間每隔20min吹打1次，1 000r／min離心5min，棄上清，加入含200U／mL雙抗的完全DMEM培養(yǎng)基，吹打使細(xì)胞懸浮，再次1 000r／min離心5min，加入完全培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸，使用吸管反復(fù)輕輕吹打2min后，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾除去大塊組織，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，24h后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞覆蓋至瓶底80%即可傳代，選取4～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 FliⅠsiRNA的轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105，接種于6孔板中，細(xì)胞鋪板36h后用于轉(zhuǎn)染，在室溫下FliⅠsiRNA（250μL；優(yōu)化，以最終濃度為100nmol／L）與250μL Lipo fectamine 2000在低血清培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中溫育20 min，每孔加入4μL Lipofectamine 2000復(fù)合物，混合，孵育6h后換液，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育。

1.5.1 WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將實(shí)驗(yàn)分為空白組、Lipo2000組、FLiⅠsiRNA組、FLiⅠcDNA組，取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以1×105／孔接種于96孔板中，置入37℃培養(yǎng)箱中孵育。24 h后按上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種后，分別檢測(cè)在0、12、24、48h細(xì)胞增殖情況，37℃培養(yǎng)箱孵育4h后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A）值，測(cè)量波長(zhǎng)450nm，記錄結(jié)果。

1.5.2 RT-PCR檢測(cè)FliⅠ、COL-1mRNA的表達(dá) 以TRIzol法提取成纖維細(xì)胞總RNA，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，以mRNA為模板，Random為引物，1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，cDNA連同特異性引物的最終濃度為1×SYBR Green，1×Amplitaq PCR buffer，3mmol／L MgCl2，dNTPs（200μmol／L），引物0.9 μmol（上游和下游），25μL H2O中AmpliTaq Gold DNA聚合酶1.25單位，內(nèi)參NADPH的反應(yīng)體系和條件同上。分別計(jì)算FliⅠ、COL-1與內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值來(lái)反映目的基因的表達(dá)強(qiáng)度。

1.5.3 Westem blot法檢測(cè)FliⅠ、COL-1蛋白的表達(dá) 將收集的細(xì)胞加入50mmol／L裂解液（Tris pH＝7.5，1mmol／L EDTA中，50mmol／L NaCl，0.5%Triton-X-100），持續(xù)振搖30 min，離心，將上清轉(zhuǎn)入4℃的離心管，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣50μL，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，脫脂，根據(jù)分子量分開(kāi)后分別加一抗（FliⅠ、COL-1稀釋比例）及內(nèi)參抗體（β-actin，1∶3 000）室溫孵育2h，HRP標(biāo)記二抗孵育1h后，ECL發(fā)光液發(fā)光后X光片曝光，各步驟之間樣品清洗3次，掃描記錄結(jié)果，Gel-analyze分析軟件分析條帶灰度，進(jìn)行半量比較分析，以目的基因的條帶灰度與內(nèi)參β-actin的灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，對(duì)于不是正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后48h，各組成纖維細(xì)胞平均A值分別為：空白組0.934±0.153，Lipo2000組0.910±0.084，F(xiàn)liⅠsiRNA組1.330±0.216，F(xiàn)liⅠcDNA組0.607±0.042，F(xiàn)liⅠsiRNA組細(xì)胞增殖水平明顯高于其他3組（P＜0.05）；FliⅠcDNA組細(xì)胞增殖水平明顯低于其他3組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 WST-1法檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞活力（±s，n＝6）

表1 WST-1法檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞活力（±s，n＝6）

a：P＜0.05，與空白組比較；b：P＜0.05，與Lipo2000組比較。

組別0.153 Lipo2000組 0.534±0.085 0.589±0.074 0.687±0.089 0.910±0.084 FliⅠsiRNA組 0.493±0.023 0.542±0.038 0.716±0.057 ab 1.330±0.216 ab FliⅠcDNA組 0.479±0.087 0.583±0.114 0.546±0.063 0.607±0.042 0h 12h 24h 48h空白組 0.512±0.104 0.609±0.063 0.699±0.141 0.934±ab

2.2 轉(zhuǎn)染后瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠ、COL-1mRNA的表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，各組內(nèi)參GAPDH mRNA擴(kuò)增條帶亮度強(qiáng)弱差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以與GAPDH同比例的模板量加入，各組FliⅠmRNA與COL-1mRNA的擴(kuò)增條帶亮度具有明顯差異，與空白組比較，F(xiàn)LiⅠsiRNA組FliⅠmRNA、COL-1mRNA表達(dá)顯著減弱，F(xiàn)LiⅠcDNA組FliⅠmRNA、COL-1mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以空白組的亮度為基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，F(xiàn)liⅠsiRNA組的FliⅠ與COL-1擴(kuò)增產(chǎn)物條帶相對(duì)灰度值分別降低至0.194±0.023和0.316±0.176，且均低于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而FLiⅠcDNA組的FliⅠ與COL-1擴(kuò)增產(chǎn)物條帶相對(duì)灰度值分別升高至7.846±1.075和9.842±1.659，均高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2，圖1。

表2 RT-PCR檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠmRNA、COL-1mRNA的相對(duì)表達(dá)情況（±s）

表2 RT-PCR檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠmRNA、COL-1mRNA的相對(duì)表達(dá)情況（±s）

a：P＜0.01，與空白組比較；b：P＜0.01，與Lipo2000組比較。

組別 FliⅠ2.931±0.514 4.872±0.937轉(zhuǎn)染Lipo2000組 2.524±0.742 4.167±1.130 FLiI siRNA組 0.194±0.023ab 0.316±0.176ab FLiI cDNA組 7.846±1.075ab 9.842±1.659 COL-1空白組ab

圖1 FliⅠmRNA、COL-1mRNA的表達(dá)

表3 Western blot法檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠ、COL-1蛋白的相對(duì)表達(dá)情況（±s）

表3 Western blot法檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠ、COL-1蛋白的相對(duì)表達(dá)情況（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與空白組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與Lipo2000組比較。

組別 FliⅠ0.731±0.043 0.675±0.255轉(zhuǎn)染Lipo2000組 0.694±0.093 0.590±0.124 FLiI siRNA組 0.153±0.075bd 0.216±0.030bd FLiI cDNA組 1.341±0.248ac 1.142±0.391 COL-1空白組ac

圖2 FliⅠ、COL-1蛋白的表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染后瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠ、COL-1蛋白的表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組及Lipo2000組比較，F(xiàn)LiⅠsiRNA組的成纖維細(xì)胞中FliⅠ、COL-1蛋白表達(dá)顯著減弱（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)LiⅠcDNA組細(xì)胞中FliⅠ、COL-1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表3，圖2。

3 討論

損傷修復(fù)是高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，需要細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的參與是這一過(guò)程至關(guān)重要的部分。瘢痕是創(chuàng)傷愈合領(lǐng)域的常見(jiàn)病、多發(fā)病[3]，因其破壞正常皮膚的完整性，影響美觀，并伴瘙癢、疼痛等不適及繼發(fā)攣縮導(dǎo)致表皮器官和關(guān)節(jié)畸形改變，影響功能和生活質(zhì)量，給患者及家屬帶來(lái)嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)[6]。因此，探索瘢痕的發(fā)病機(jī)制及治療方法具有重要的意義。瘢痕是全層缺損的創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子等相互調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果，其主要表現(xiàn)為是成纖維大量增殖，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積及細(xì)胞因子分泌失常，膠原超常合成沉積與降解減少[7]。研究表明，F(xiàn)liⅠ是創(chuàng)傷修復(fù)的重要介質(zhì)，能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和活力，在FliⅠ基因低表達(dá)的雜交小鼠中損傷修復(fù)增強(qiáng)，而FliⅠ基因高表達(dá)的小鼠損傷修復(fù)顯著降低[8]。FliⅠ首次被定義為果蠅不規(guī)則的肌動(dòng)蛋白組織和有缺陷的飛行肌的基因突變?cè)斐傻腫9]，與人類(lèi)同源的FliⅠ基因有直接關(guān)系[10]，此蛋白能大大影響創(chuàng)傷愈合過(guò)程中細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)liⅠ在小鼠體內(nèi)和體外的成纖維細(xì)胞中均有發(fā)現(xiàn)，并且在體外能連接斷裂的纖絲狀肌動(dòng)蛋白，因此FliⅠ對(duì)組織修復(fù)的細(xì)胞機(jī)制具有重要的生物學(xué)意義[11]。課題組前期研究表明，創(chuàng)面愈合FliⅠ主要表達(dá)于皮膚真皮成纖維細(xì)胞核中，隨著創(chuàng)面逐漸愈合其表達(dá)開(kāi)始減弱。Ⅰ型膠原蛋白是一種重要的基質(zhì)蛋白，是瘢痕組織中膠原纖維的主要成分，是損傷產(chǎn)生的主要形式，參與組織纖維化和瘢痕的形成，其表達(dá)對(duì)創(chuàng)傷后瘢痕的形成具有重要的影響[12]，且FliⅠ對(duì)COL-1的調(diào)控可能具有重要的意義[13]。

正常情況下，傷口內(nèi)的膠原合成與分解呈動(dòng)態(tài)平衡，在某些情況下，這種平衡被打破，導(dǎo)致成纖維、肌纖維母細(xì)胞合成膠原增多，而膠原纖維分解減少，膠原合成速度遠(yuǎn)大于膠原分解，最終導(dǎo)致了膠原沉積，從而形成瘢痕組織[14]。研究證實(shí)，F(xiàn)liⅠ涉及細(xì)胞的增殖和遷移，并且過(guò)程中可能通過(guò)其肌動(dòng)蛋白切斷功能產(chǎn)生負(fù)調(diào)節(jié)。本研究將小分子RNA片段和FliⅠ過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48h，通過(guò)WST-1法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瘢痕成纖維細(xì)胞FliⅠ沉默后，其增殖水平明顯高于其他3組（P＜0.05）；而FliⅠcDNA組成纖維細(xì)胞增殖水平顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明FliⅠ缺陷能顯著刺激創(chuàng)傷愈合過(guò)程中瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和活力，而FliⅠ高表達(dá)則能抑制細(xì)胞增殖，推測(cè)FliⅠ的水平在瘢痕的形成過(guò)程中具有重要作用。FliⅠ在瘢痕中的表達(dá)水平低于正常組織中的表達(dá)，成纖維細(xì)胞的主要生物學(xué)功能是合成和分泌膠原，皮膚的細(xì)胞外基質(zhì)主要是Ⅰ型和Ⅲ型前膠原，在組織結(jié)構(gòu)支撐中發(fā)揮重要作用，其中Ⅰ型前膠原抗張力性強(qiáng)，是創(chuàng)面早期瘢痕愈合的主要膠原類(lèi)物質(zhì)，其組織含量高可導(dǎo)致皮膚瘢痕僵硬[4]。本研究利用半定量RT-PCR檢測(cè)病理性瘢痕組織中FliⅠmRNA和COL-1mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FLiI siRNA組FliⅠmRNA、COL-1mRNA表達(dá)較其他3組顯著減弱，F(xiàn)LiⅠcDNA組FliⅠmRNA、COL-1mRNA表達(dá)較其他3組增強(qiáng)，F(xiàn)liⅠ缺失直接導(dǎo)致FliⅠ、COL-1mRNA及蛋白表達(dá)水平下降，說(shuō)明FliⅠ的高表達(dá)能促進(jìn)COL-1mRNA及蛋白的表達(dá)，COL-1酶的合成增加使細(xì)胞外基質(zhì)-膠原的分泌減少，從而抑制病理性瘢痕組織的形成。提示轉(zhuǎn)染的1型膠原基因核酶可抑制成纖維細(xì)胞合成膠原酶，導(dǎo)致瘢痕中膠原含量增加，產(chǎn)生病理性瘢痕組織。

病理性瘢痕組織中FliⅠ表達(dá)極低，低濃度的FliⅠ刺激成纖維細(xì)胞增殖，使成纖維細(xì)胞數(shù)量增加，膠原酶合成減少導(dǎo)致膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的分泌增加，細(xì)胞外基質(zhì)沉積也增多，可能是病理性瘢痕形成的機(jī)制之一。因此，采用基因逆轉(zhuǎn)錄的方法得到FliⅠcDNA基因并與質(zhì)?；虿《镜然蜉d體整合，轉(zhuǎn)移至瘢痕成纖維細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)篩選、培養(yǎng)，得到FliⅠcDNA的克隆株，采用基因治療為臨床治愈瘢痕提供參考。

[1] 陳振雨，魏愛(ài)華，張維娜，等.病理性瘢痕組織iNOS和5-HT表達(dá)及與其增生和痛癢的關(guān)系[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，42（3）：231-234

[2] 張曦.角質(zhì)形成細(xì)胞源性蛋白因子在增生性瘢痕形成中的作用研究[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2008.

[3] Kopecki，Z，Cowin AJ.FlightlessⅠ：an actin-remodelling protein and an important negative regulator of wound repair[J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40（8）：1415-1419.

[4] 劉寶珩.mac調(diào)節(jié)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡[D].西安：第三軍醫(yī)大學(xué)，2013.

[5] 林偉華，李葉揚(yáng)，米蘭，等.整合素連接激酶對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和分化的影響[J].中華整形外科雜志，2014，30（1）：45-49.

[6] 周孝亮.粉防己堿對(duì)兔耳瘢痕增生組織I、III型膠原及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1基因表達(dá)的調(diào)控作用[D].南昌：南昌大學(xué)，2012.

[7] 姜篤銀，付小兵，盛志勇.瘢痕組織愈合中成纖維細(xì)胞凋亡抗性及其臨床意義[J].中華外科雜志，2006，56（7）：496-498.

[8] Adams DH.Gender specific effects on the actin-remodelling protein FlightlessⅠand TGF-1contribute to impaired wound healing in aged skin[J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40（8）：1555-1569.

[9] Campbell HD，Schimansky T，Claudianos C，et al.（1993）.The Drosophilamelanogaster flightless-Ⅰgene involved in gastrulation and muscledegeneration encodes gelsolin-like and leucine-rich repeatdomains and is conserved in Caenorhabditis elegans and humans[J].Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（23），11386-11390.

[10] Campbell HD，F(xiàn)ountain S，Young IG，et al.Genomic structure，evolution，and expression of human FLⅡ，agelsolin and leucine-richrepeatfamily member：overlap with LLGL[J].Genomics，1997，42（1）：46-54.

[11] Davy DA，Ball EE，Matthaei KI，et al.The flightlessⅠprotein localizes to actin-based structures during embryonic development[J].Immunol Cell Biol，2000，78（4）：423-429.

[12] Gowin AJ，Adams DH，Strudwick XL，et al.FlightlessⅠdeficiency enhances wound repair by increasing cell migration and proliferation[J].J Pathol，2007，211（5）：572-581.

[13] Adams DH，Strudwick XL，Kopecki Z，et al.Gender specific effects on the actin-remodelling protein FlightlessⅠand TGF-beta1contribute to impaired wound healing in aged skin[J].Int J Biochem Cell Biol，2008，40（8）：1555-1569.

[14] 閆貴春，裴銀輝.瘢痕發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2010，19（8）：1251-1255.