黑龍江省部分地區(qū)非綜合征型聾患者GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12S rRNA基因檢測(cè)結(jié)果分析△

王春英劉平崔忠濤馮淼徐平

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院耳鼻咽喉科(哈爾濱　150001) ; 2黑龍江省醫(yī)院

黑龍江省部分地區(qū)非綜合征型聾患者GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12S rRNA基因檢測(cè)結(jié)果分析△

王春英1劉平2崔忠濤1馮淼1徐平1

1哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院耳鼻咽喉科(哈爾濱150001) ; 2黑龍江省醫(yī)院

【摘要】目的調(diào)查黑龍江省非綜合征型聾(NSHL)患者三種常見(jiàn)聾病易感基因的突變特征。方法對(duì)380 例NSHL患者(患者組)和202例聽(tīng)力正常人(對(duì)照組)，采集靜脈血DNA，用PCR方法檢測(cè)GJB2、SLC26A4 2168和IVS7-2 A＞G位點(diǎn)以及線粒體DNA 12S rRNA基因突變情況。結(jié)果所有受試者中共檢測(cè)出5種GJB2致病突變和2種SLC 26A4致病突變。患者組中，76例(20.01%)患者攜帶雜合或純合GJB2 235 del C突變，突變率最高，其次為c.299-300 del AT，占7.37%(28/380)。SLC26A4基因2168和IVS7-2 A＞G雜合或純合突變者分別為14例和27例，包括正常對(duì)照組SLC26A4 IVS7-2 A＞G雜合突變4例;患者組中3例為SLC26A4 2168和SLC26A4 IVS7-2復(fù)合雜合突變。檢測(cè)出1例NSHL患者線粒體12S rRNAm.1555A＞G純合突變。結(jié)論GJB2 c.235 del C 和SLC26A4 IVS7-2 A＞G是黑龍江省部分地區(qū)的高發(fā)致病基因突變。

【關(guān)鍵詞】NSHL; GJB2; SLC26A4; 12S rRNA

△黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(D201068)資助

研究顯示，50%～70%的聽(tīng)力障礙與遺傳因素有關(guān)［1，2］，其中，70%的遺傳性聾屬于非綜合征型聽(tīng)力損失。目前，已知有很多基因都與非綜合征型聾有關(guān)，一個(gè)或幾個(gè)基因存在突變，或一個(gè)基因中的不同位點(diǎn)存在突變，都會(huì)引起耳聾。在不同種族，甚至同一種族不同地區(qū)的人群中，耳聾基因及其突變位點(diǎn)不盡相同。GJB2、SLC26A4、線粒體基因(A1555G 和C1494T突變)是導(dǎo)致中國(guó)大部分遺傳性聾的三個(gè)最常見(jiàn)基因。因此，為了調(diào)查黑龍江省部分地區(qū)聾病易感基因突變的情況，近年來(lái)對(duì)該地區(qū)非綜合征型聾患者上述三種耳聾易感基因的突變情況進(jìn)行了檢測(cè)，希望為本地區(qū)的防聾治聾工作提供流行病學(xué)資料。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象收集來(lái)自黑龍江省哈爾濱市、齊齊哈爾市、牡丹江市、綏化地區(qū)及佳木斯市2011年9月來(lái)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受義診及2011年9月至2013年10月到門診就診的散發(fā)病例中診斷為非綜合征型聾的患者共380例(患者組)，男181例，女199例，均為漢族;年齡0.5～38歲，平均10.5 ±10.9歲;其中277例為語(yǔ)前聾或先天性聾，且程度在中、重度聾及以上。同時(shí)隨機(jī)收集聽(tīng)力正常且無(wú)耳聾家族史的202人作為正常對(duì)照組。

1.2病史及標(biāo)本采集采用問(wèn)卷調(diào)查形式，調(diào)查表內(nèi)容涉及患者基本信息及耳聾史、家族史、高危因素等，并由患者或其監(jiān)護(hù)人填寫。本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，對(duì)所有研究對(duì)象的臨床信息和血樣采集，均獲得了患者本人或其監(jiān)護(hù)人的同意，并簽署了知情同意書。

1.3聽(tīng)力學(xué)檢查對(duì)所有受試者進(jìn)行聽(tīng)力學(xué)檢查，包括純音測(cè)聽(tīng)、聲導(dǎo)抗、ABR、瞬態(tài)誘發(fā)耳聲發(fā)射。耳聾分級(jí)以WHO 1997年聽(tīng)力障礙分級(jí)為標(biāo)準(zhǔn)［3］，即聽(tīng)閾在26～40 dB HL為輕度聾; 41～60 dB HL為中度聾; 61～80 dB HL為重度聾;大于81 dB HL為極重度聾。

1.4GJB2、SLC26A4和線粒體12S rRNA基因的突變檢測(cè)對(duì)380例NSHL患者和202例正常對(duì)照組進(jìn)行GJB2、SLC26A4基因2168和IVS7-2 A＞G位點(diǎn)和線粒體12S rRNA基因的突變分析。提取靜脈全血DNA(天根生化科技，中國(guó)北京)，隨后進(jìn)行PCR。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為95℃3分鐘，95℃30秒、59℃30秒、72℃1分鐘4個(gè)循環(huán)，95 ℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘29個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，隨后進(jìn)行純化(天根生化科技，中國(guó)北京)，最后通過(guò)GenomeLab GeXP多功能遺傳分析系統(tǒng)(Beckman，USA)進(jìn)行測(cè)序。

表1　GJB2、SLC26A4和線粒體12S rRNA基因所在區(qū)段引物序列

2　結(jié)果

各基因檢出突變位點(diǎn)見(jiàn)表2。

2.1GJB2基因突變檢測(cè)結(jié)果在380例患者和202例正常對(duì)照組中共檢測(cè)到7種GJB2基因突變，其中5種為致病性突變。在380例耳聾患者中，c.235 del C是最常見(jiàn)的突變類型，約占20.0% (76/380)，其次為c.299-300 del AT，約占7.37% (28/380)。對(duì)照組只有2例檢測(cè)到c.235 del C雜合突變，2例c.109 G＞A雜合突變(表3)。380例患者中，檢測(cè)到1例c.35 del G和c.235 del C GJB2復(fù)合雜合突變，4例c.235 del C和c.299-300 del AT復(fù)合雜合突變，1例c.176 del 16和c.299-300 del AT復(fù)合雜合突變，1例c.35 del G、c.176 del 16和c.235 del c復(fù)合雜合突變，這些患者均表現(xiàn)為極重度聾。

2.2SLC26A4基因突變檢測(cè)結(jié)果本研究分別檢測(cè)出14例SLC26A4 2168突變和27例SLC26A4 IVS7-2突變(其中3例同時(shí)檢出這兩種突變)，其中包括正常對(duì)照組中的4例SLC26A4雜合突變?；颊呓M中3例(ID4，ID26，ID125)檢測(cè)出SLC26A4 2168和SLC26A4 IVS7-2復(fù)合雜合突變的患者均表現(xiàn)為極重度聾，且伴有前庭水管擴(kuò)大(已由MRI證實(shí)) ;追蹤家族史，其中一例患者(ID4)的父母分別為SLC26A4 2168雜合突變和SLC26A4 IVS7-2雜合突變，聽(tīng)力檢測(cè)正常;一例患者(ID125)的父親為SLC26A4 2168雜合突變，祖父未檢出SLC26A4 2168突變和SLC26A4 IVS7-2突變，祖母為SLC26A4 IVS7-2雜合突變，這三位家屬聽(tīng)力均正常;上述2例患者的家屬均未納入到正常對(duì)照組中。本研究中34例攜帶SLC26A4 2168突變和/或SLC26A4 IVS7-2突變的患者中，21例接受了影像學(xué)檢查，均證實(shí)為大前庭水管綜合征。

2.3線粒體DNA 12S rRNA基因突變檢測(cè)結(jié)果380例患者和202例正常對(duì)照組中僅患者組有1例10歲男孩檢測(cè)出m.1555A＞G純合突變，未檢測(cè)到m.1494C＞T突變。本研究中，有2例患者同時(shí)攜帶GJB2和SLC26A4突變，其中1例(ID79)同時(shí)伴有GJB2 235純合突變和SLC26A4 IVS7-2雜合突變，另一例(ID227)為同時(shí)伴有GJB2 235雜合突變和SLC26A4 IVS7-2雜合突變，且兩者均表現(xiàn)均為極重度聾。遺憾的是，本研究沒(méi)有獲得這2例患者家屬的相關(guān)信息。

表2　所有受試者檢出突變位點(diǎn)類型及基因定位

表3　所有受試者不同基因定位GJB2基因突變檢出情況(例)

3　討論

研究顯示，GJB2c.235del C是大多數(shù)亞洲人最常見(jiàn)的突變類型［4，5］。本組380例NSHL患者和202例正常對(duì)照組中，共檢測(cè)到7種GJB2突變，其中c.235 del C是最常見(jiàn)的耳聾相關(guān)性突變，約占20%，略高于我國(guó)以往其他的報(bào)道［4，6，7］?；颊呓M中10例(10/380，2.6%)檢測(cè)到GJB2 109 G＞A，對(duì)照組未檢測(cè)到該突變，以往Chen［6］的研究認(rèn)為該位點(diǎn)為基因多態(tài)性，而Wei［5］的研究認(rèn)為該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?，本研究?jī)A向于后者。Cryns等［8］認(rèn)為GJB2突變的基因型在耳聾的程度上扮演著十分重要的角色; Huang［9］的研究顯示，在GJB2、SLC26A4或線粒體基因突變患者中，GJB2基因突變致聾的患者聽(tīng)力水平最差。本研究中檢測(cè)到的7例GJB2復(fù)合突變的患者均表現(xiàn)為先天性重度聾，充分說(shuō)明了這一點(diǎn)。胡華梅等［10］曾報(bào)道GJB2基因突變具有較高的攜帶率，若夫妻雙方都為該基因的雜合突變時(shí)，建議行耳聾基因產(chǎn)前篩查，可以有效地避免耳聾患兒的出生。

本研究中，34例患者攜帶有SLC 26A4基因突變，正常對(duì)照組中檢測(cè)出4例攜帶SLC26A4雜合突變。其中患者組中的兩例患者家屬分別為SLC26A4 IVS7-2或SLC26A4 2168位點(diǎn)的雜合突變，且聽(tīng)力正常，而這2例患者均為兩種突變的復(fù)合雜合型突變，表現(xiàn)為極重度聾，說(shuō)明對(duì)于正常人群耳聾基因的篩查也很重要。此外，攜帶SLC26A4基因突變的患者極有可能為大前庭水管綜合征(EVA)，為了明確診斷，應(yīng)盡快進(jìn)行影像學(xué)檢查。本研究中的34例患者中有21例進(jìn)行了影像學(xué)檢查，經(jīng)證實(shí)均為大前庭水管綜合征。此類患者應(yīng)避免劇烈運(yùn)動(dòng)、外傷以及碰撞等可能導(dǎo)致聽(tīng)力惡化因素［11］。

約20%的語(yǔ)后聾可能是由于線粒體基因突變所引起的，但可能存在種族差異［12］。本研究中，僅患者組有1例(0.17%，1/582) 10歲的男孩檢測(cè)到m.1555A＞G純合突變，未檢測(cè)到m.1494C＞T和新的突變，結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Guo等［13］報(bào)道的51.11%，同時(shí)也低于Yang等關(guān)于我國(guó)西北地區(qū)的報(bào)道［14］。這可能與本研究的患者組大部分為先天性聾或語(yǔ)前聾有關(guān)。

耳聾病因復(fù)雜，與之相關(guān)的基因也較多，故明確該病的致病機(jī)理是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)，由于其具有地區(qū)和種族的差異性，需要較多的研究人員投入到該項(xiàng)工作中來(lái)，為優(yōu)生優(yōu)育以及預(yù)防耳聾的發(fā)生提供寶貴資料。本研究結(jié)果顯示: GJB2 c.235 del C和SLC26A4 IVS7-2 A＞G是黑龍江省部分地區(qū)的高發(fā)致病突變位點(diǎn)，這一結(jié)論與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相一致，本研究結(jié)果為黑龍江地區(qū)的耳聾預(yù)防奠定了一定的基礎(chǔ)，豐富了耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)可為今后臨床醫(yī)師診斷、治療及遺傳咨詢提供參考。

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(2014-09-09收稿)

(本文編輯李翠娥)

·研究報(bào)告·

通訊作者:徐平(Email: panjing_1981@126.com)

【中圖分類號(hào)】R764.43

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2015) 06-0651-03

DOI:10.3969/j.issn.1006-7299.2015.06.020

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-9-10 16: 47

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20150910.1647.026.html