堿提取法從虎杖中分離白藜蘆醇的方法研究

李保利，王 芳，彭宏艷

（安陽工學院，河南安陽455000）

白藜蘆醇是多酚類物質[1]，具有抗菌消炎，降血脂，預防心血管疾病，抗腫瘤，對治療心腦血管疾病有很好的效果[2-4]，并且毒副作用很小，有利于長期作為治療藥物應用于臨床治療，尤其是在心血管類疾病和癌癥的防治上具有良好的應用前景[5]。紫杉醇曾被認為是一種抗癌藥和新型保健品的藥用成分，而白藜蘆醇的出現則被認為是繼紫杉醇之后又一極具潛力的抗癌防癌新藥。

近年來，隨著人們在對白藜蘆醇的研究，發(fā)現中藥虎杖中含有豐富的白藜蘆醇。盡人皆知，中藥是中華民族傳統(tǒng)文化特色的一部分，我們對中藥的研究博大精深，集中力量研究虎杖中白藜蘆醇提取方法，找出合理有效的分離純化技術，必將產生顯著的經濟和社會效益。目前對虎杖的提取大多采用溶劑提取法，如乙醇法、超聲波提取法等[6]，本實驗對虎杖中白藜蘆醇的提取采用堿提取法，該方法簡單易行、經濟，減少了化學試劑的污染。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

虎杖（Polygonum Cuspidatum），安陽天大藥房，產地山西；氫氧化鉀，分析純，天津市北方化玻購銷中心；氫氧化鈉，分析純，天津市進豐化工有限公司；碳酸氫鈉，分析純，天津市進豐化工有限公司；無水碳酸鈉，分析純，天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；鹽酸，分析純，洛陽市化學試劑廠；甲醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

CP214電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；T6新世紀紫外分光光度，北京普析通用儀器有限公司；Spectrum RX-1 紅外光譜儀，美國Perkin Elmer 公司；SHZ-D(Ⅲ)水循環(huán)真空泵，鄭州鞏義予華儀器公司；電熱鼓風干燥箱，天津華北試驗儀器公司；FW135中藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗原理

白藜蘆醇和茶多酚結構式如下：

白藜蘆醇和茶多酚都屬于多元酚類物質，并且具有弱酸性。應用堿提取酸沉淀的方法提取茶多酚的研究多見于報道，據此，白藜蘆醇的提取采用該法應該可行。利用白藜蘆醇在堿性水溶液中成鹽而溶解能力增大的性質，用堿水為溶劑煮沸提取，然后在堿水提取液加酸酸化后，白藜蘆醇的酚鹽重新轉化成低水溶性的白藜蘆醇，從而使白藜蘆醇以沉淀形式從溶液中分離出來[7-9]。

2 結果與討論

2.1 pH值對提取物的影響

通過用KOH 調節(jié)蒸餾水不同pH 值所得到的提取物產量以及相應的紫外吸收數據的整理，得到pH 值對提取物產量和吸光度影響的曲線圖，如圖1和圖2。

由圖1 和圖2 可知，pH 值為10 時提取物吸光度最大，提取物的產量也比較大，說明該條件下白藜蘆醇的提取效果比較好；雖然pH 值為14 時，所得產量很大，但是吸光度卻很小，說明提取物中所含雜質非常多，白藜蘆醇的含量就會相對很少，并且不利于進一步的純化工作；當pH值為8和pH值為12時，雖然吸光度不是特別低，但是所得到的提取物產量過少，所以選擇pH=10 為堿提的最佳pH值。

2.2 不同無機堿對提取物產量的影響

用不同無機堿對提取物產量的影響實驗所記錄的數據結果，得到如圖3所示的曲線關系圖。

由圖3 可知，4 種不同無機堿調節(jié)實驗所用的蒸餾水的pH 值，采用氫氧化鉀時，所得提取物產量最大。而用碳酸氫鈉和碳酸鈉調節(jié)pH 值時，所得提取物產量較低，其原因可能是：碳酸氫鈉和碳酸鈉是強堿弱酸鹽，在相同pH 值下酚羥基轉化為游離酚鈉基團的數量和程度不夠。

2.3 原料粒度對提取物產量和真空抽濾時間的影響

原料粒度對提取物產量和真空抽濾時間的影響如圖4和表1。

表1 原料粒度對真空抽濾時間的影響

由圖4 可以看出，當原料粒度為20 目時的提取物產量要低于過40目和60目時提取物的產量，原因可能是：雖然所用抽濾時間很短，但是由于過20 目篩子時得到的虎杖粉末粒度較大，在浸泡時不利于白藜蘆醇的浸出。當篩子目數為80 和100時，所得提取物產量很低，原因可能是：1）虎杖粉末粒度太小，浸泡過程中水溶性糖增多，煮沸之后，成為黏稠糊狀物，很難抽濾，得到的濾液很少，致使產量很少；2）白藜蘆醇是光解性物質，原料粒度在80～100 目時，所用抽濾時間特別長，白藜蘆醇光解較多。當篩子目數為40目和60目時，所得提取物產量相差不大，但是如表1 所示，原料粒度為40目時所用抽濾時間比60目時節(jié)省將近2個小時。綜上所述，堿提取時虎杖粒度以40目為最佳。

2.4 浸泡時間對提取物產量的影響

通過對浸泡時間因素影響實驗數據結果的整理，得到如圖5的曲線關系圖。

由圖5可以看出，浸泡時間為8 h時，得到的提取物產量較低，可能是虎杖粉末不能充分潤漲，在恒速、均勻攪拌，加熱煮沸時，不利于產物的分離；由圖可以看出，浸泡時間為20 h時，得到的提取物產量反而減小，可能原因是：一部分白藜蘆醇受光分解；浸泡時間為12 h和16 h時，得到的產物分別為0.3698 g 和0.3780 g，雖然浸泡時間為16 h 時的產量稍高，但是所用時間較長，考慮到綜合效益，浸泡時間選擇12 h為好。

2.5 用1 mol/L 的鹽酸調節(jié)不同pH 值對提取物產量的影響

通過對1 mol/L 的鹽酸調節(jié)不同pH 值對提取物產量和吸光度影響的實驗數據結果整理，得到如圖6和圖7的曲線關系圖。

綜合圖6 和圖7 分析可知，當pH=4 和pH=5 時提取物的產量低并且吸光度小，可能原因是此時白藜蘆醇沉淀不完全；當pH=2 和pH=3 時的產量差別很小，分別為0.2487 g 和0.2483 g，由圖7 可知，pH=2時提取物的吸光度較小，所以此時白藜蘆醇含量較??；綜合兩者可以得出，選擇pH=3 為酸沉淀的條件較好。

2.6 紫外分光光度法對白藜蘆醇的檢測

白藜蘆醇是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，自然界存在有順式(cis-)和反式(trans-)兩種構型異構體，白藜蘆醇的結構式為[7]：

白藜蘆醇反式異構體的生物活性強于順式異構體，在紫外光照射下反式白藜蘆醇能夠轉化為其順式異構體。反式與順式白藜蘆醇在紫外光(UV)210 nm 處有強吸收，其第二吸收峰在分別在305～330 nm和280～295 nm[10]。

稱量最佳條件下得到的白藜蘆醇提取物0.1000 g，溶解于適量甲醇溶液，配制白藜蘆醇粗提物濃度為0.04g/L，即為做紫外分光光度實驗所用溶液。

用甲醇做空白，測得上述溶液的紫外圖如圖8所示。

由圖8可以看出，產物在紫外光200 nm與300 nm 之間有兩個吸收峰，峰的位置是212 nm 處和282 nm 處，結果與文獻[10]的出峰波長范圍相一致，說明提取物中的確含有白藜蘆醇。

2.7 紅外分光光度法對白藜蘆醇的檢測

白藜蘆醇紅外掃描圖譜的特征吸收峰：3250cm-1處的為酚羥基吸收峰；1620、1540、1500 cm-1處的為苯環(huán)吸收峰；965 cm-1處的為反式碳碳雙鍵的特征吸收峰，700 cm-1處的為順式碳碳雙鍵的特征吸收峰[11]。

如圖9所示為得到的粗提物的紅外光譜曲線，通過對記錄數據分析：在3448 cm-1處的為酚羥基吸收峰，1616 cm-1、1560 cm-1、1500 cm-1處的為苯環(huán)吸收峰，960 cm-1處的為反式碳碳雙鍵的特征吸收峰，712 cm-1處的為順式碳碳雙鍵的特征吸收峰，由此可確定粗提物中含有白藜蘆醇。

3 結論

實驗采用單因素實驗，考察了原料粒度、無機堿的種類及用量、pH值、浸泡時間等因素對白藜蘆醇提取的影響，得出白藜蘆醇堿提酸沉的最佳條件：原料粒度為過40 目篩，提取溶劑用氫氧化鉀，調節(jié)蒸餾水pH 值為10，浸泡12 h 加熱煮沸1 h，濾液用1 mol/L的鹽酸調節(jié)pH值為3，放置沉淀。

所得到的粗提物經過紫外光譜檢測分析，得到圖譜與文獻所記錄的白藜蘆醇出峰位置一致，據此判斷粗提物中確實含有白藜蘆醇。由紅外圖譜分析亦可確定粗提物中含有白藜蘆醇。下一步努力的方向是得到虎杖粗提物中白藜蘆醇的精確含量，再探索比如土茯苓，葡萄籽，花生紅衣等富含白藜蘆醇的原料中白藜蘆醇的精確含量。為新藥的開發(fā)提供一定的基礎。

[l]孔曉華，周玲芝.中藥虎杖的研究進展[J].中醫(yī)藥導報，2009，15(5)：107-110.

[2]孟雪蓮，楊靜玉，吳春福.白黎蘆醇的藥理學作用研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2008,25(2)：51-52.

[3]張?zhí)m勝，劉光明.白黎蘆醇的研究概述[J].大理學院學報，2007，6(4)：72-75.

[4]王永紅，何麗君，李生英，等.白黎蘆醇[J].甘肅高師學報，2009，14(2)：54-56.

[5]M I Fernandez-Mar,R Mateos,M C Garcia-Parrilla,et al.Bioactive compounds in wine：Resveratrol,hydroxytyrosol and melatonin：A review[J].Food Chemistry,2012,130(4)：797-813.

[6]毛俊霞.葡萄葉中白藜蘆醇的提取和分離純化研究[D].西安：陜西師范大學，2013.

[7]袁珂.從綠茶葉中提取茶多酚的工藝方法[J].林產化學與工業(yè)，1997，17(1)：56-60.

[8]張茵，荀玉芳，李燁.從綠茶中提取茶多酚的工藝研究[J].淮海工學院學報（自然科學版），2007，16(4)：38-41.

[9]張志香，陳召峰.茶葉中提取茶多酚的研究[J].廣東化工，2012，39(2)：70-71

[10]續(xù)穎.花生莖中白藜蘆醇提取及抗氧化活性的研究[D].南寧：廣西大學，2009.

[11]姚寶書，齊崴.從葡萄皮渣中提取白藜蘆醇的研究[J].天津輕工業(yè)學院學報，1999，7(4)：8-15.