中國狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)進化分析

張洪海，竇海龍，陳 磊，沙未來，趙俊杰

1 曲阜師范大學生命科學學院, 曲阜 273165 2 北京師范大學生命科學學院, 北京 100875

中國狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)進化分析

張洪海1,*，竇海龍1,2，陳 磊1，沙未來1，趙俊杰1

1 曲阜師范大學生命科學學院, 曲阜 273165 2 北京師范大學生命科學學院, 北京 100875

為了解中國狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育情況，從中國境內狼的主要分布區(qū)青海、新疆、內蒙古和吉林4個地區(qū)采集樣品，用分子生物學技術手段成功地獲得44個個體線粒體DNA控制區(qū)第一高變區(qū)(HVR Ⅰ)序列和40個線粒體Cytb部分序列。線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ共檢測到51個變異位點，位點變異率為8.76%；線粒體Cytb部分序列發(fā)現(xiàn)31個變異位點，位點變異率為5.33%，未見插入及缺失現(xiàn)象，變異類型全部為堿基置換。共定義了16個線粒體HVR Ⅰ單倍型，其中吉林與內蒙種群存在共享單倍型，估計這兩地間種群親緣關系較近。4個地理種群中新疆種群擁有較高的遺傳多樣性(0.94)。中國狼種群總體平均核苷酸多態(tài)性為2.27%，與世界其他國家地區(qū)相比，中國狼種群擁有相對較高的遺傳多樣性。通過線粒體HVR Ⅰ單倍型構建的系統(tǒng)進化樹可以看出，中國狼在進化上分為2大支，其中位于青藏高原的青海種群獨立為一支，推測其可能長期作為獨立種群進化?；谇嗪７N群與新疆，內蒙種群的線粒體Cytb遺傳距離，推測中國狼2個世系可能在更新世冰川時期青藏高原受地質作用急速隆起后出現(xiàn)分歧，分歧時間大約在1.1 MY前。

狼; 中國; 遺傳多樣性; 系統(tǒng)進化

灰狼簡稱狼，屬于食肉目(Carnivora)、犬科(Canidae)、犬屬(Canis)，由于狼食譜寬、適應性強，曾在地球上廣泛分布[1]。狼在我國曾一度分布于除海南省、南中國海諸島嶼以及臺灣省外的廣大地區(qū)，但由于人為捕殺和生境破壞，現(xiàn)僅集中分布于人口較為稀少的內蒙古、新疆、青海、西藏等地區(qū)[2]。我國關于狼的研究主要集中在宏觀生態(tài)學方面，關于狼種群遺傳多樣性及系統(tǒng)分類地位的研究非常少，并且在狼亞種的劃分上還存在著眾多爭議：很多學者認為中國狼或蒙古狼(CanislupusChanco)與歐亞狼(CanislupusLupus)是同一個亞種[3]；中國動物志引述Pocock等和Ellerman 等的研究結論認為分布于中國境內的狼僅有蒙古狼(C.l.chanco)一個亞種[4-5]；王秀輝應用RAPAD方法將中國狼劃分為5個亞種：云貴和東南集群亞種，東北河北群體亞種、甘肅群體亞種、內蒙古群體亞種和新疆群體亞種[6]；羅理楊等通過測定中國各個地區(qū)狼線粒體控制區(qū)部分序列得出分布于青海、西藏、云南的狼種群屬于西南種群亞種，東北種群與華北種群作為一個亞種，內蒙古及新疆種群歸屬不能確定[7]。國內對狼遺傳多樣性的研究未見報道，這對于野生狼種群的管理及保護非常不利。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)不會發(fā)生遺傳重組，較核DNA有更高的突變率，因此被公認為用來作為研究動物遺傳進化的標記物質[8]。線粒體細胞色素b(Cytochrome b, Cytb)基因全長大約在1100—1200 bp之間，并且不同物種間序列長度差異較大，但是在核苷酸組成上卻具有偏好性。由于Cytb基因中含有突變和保守區(qū)，并且存在較慢和較快的進化的密碼子位點，所以Cytb基因是對動物系統(tǒng)進化研究的較好的分子標記。犬科動物線粒體控制區(qū)(Control region displacement loop, D-loop)全長1240—1360 bp，其中存在3個保守序列框(Conserved sequence block)：CSB Ⅰ、CSB Ⅱ和CSB Ⅲ[9]。起始位點位于CSB Ⅰ區(qū)5′端的第一高變區(qū)(Hypervariable region, HVR Ⅰ)序列變異速率較快，常被用來進行種群遺傳結構及系統(tǒng)地理分析[10]。近些年來，保護生物學研究已經(jīng)深入到分子水平，要求使用分子實驗技術從大量動物樣本中提取DNA以獲取動物的遺傳信息。在采集分析樣品的過程中，傳統(tǒng)的取樣方法(通過殺死動物來獲取新鮮的組織或捕獲動物抽取血液)對于野外動物種群特別是瀕危珍稀動物種群較難實現(xiàn)。因此本研究采集了來自青海、新疆及內蒙、吉林4個地區(qū)55個樣品，且多數(shù)樣品采用非損傷取樣的方法獲得。通過分子生物學手段成功獲得44個個體線粒體D-Loop區(qū)HVR Ⅰ序列和40個線粒體Cytb部分序列，對其進行遺傳學分析，探討各地種群遺傳多樣性高低并分析其系統(tǒng)進化地位。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究于2011年12月至2012年6月分別在青新疆阿勒泰地區(qū)、內蒙古西旗、內蒙古達賚湖自然保護區(qū)、吉林圖門市共采集樣品55份，且樣品多數(shù)來自于野外捕捉的圈養(yǎng)狼(樣本詳細資料見表1)。所有糞便樣品一律置于-20 ℃冰箱中保存，肌肉組織置于-80 ℃冰箱中保存，采集皮毛組織均為自然風干后置于常溫干燥環(huán)境下保存，血液樣品加入抗凝劑后使用生物低溫采樣箱運送至實驗室-80℃冰箱中保存。

表1 狼樣品基本信息表Table 1 Basic information of all the wolves samples

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品DNA的提取

由于在分子生物學研究中，應用毛皮或者糞便樣品為DNA 來源時，獲得的DNA 含量相對于其他組織樣品較低，可能會對后續(xù)實驗造成影響以致無法獲得準確的結果，因此針對這種情況，本研究采用重復提取的方法，對同一樣品分別獨立操作兩次，獲得的DNA分別置于-20℃冰箱保存并用于后續(xù)實驗。糞便中總DNA的提取使用糞便提取試劑盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit，USA)。血液，毛皮及肌肉組織DNA的提取使用血液及組織提取試劑盒(QIAamp DNeasy Blood & Tissue Kit，USA)。

1.2.2 PCR擴增

狼線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ引物采用犬科動物mtDNA D-loop第一高變區(qū)的序列長度為582 bp通用引物對[11]:

L15404: 5′-CTCTTGCTCCACCATCAGC-3′

H16118: 5′ -AAACTATATGTCCTGAAACC-3′

根據(jù)Cytb內部的保守位點，選擇性的擴增了位于細胞色素b后半部分長度大約767 bp的序列，其下游包含一段tRNApro序列。引物設計使用軟件Primer 5.0及Oligo 7.5。所得引物序列為：

L14666：5′ -AGAGTGAATCTGAGGCGGCTT-3′

H15432：5′ -GCTTTGGGTGCTGATGGTGG-3′

狼控制區(qū)HVRⅠ和Cytb區(qū)PCR反應體系相同: Taq 酶0.25 μL (Takara)，10 × buffer 4 μL，10 mmol/LdNTPs (Takara)3 μL，前/后引物各0.8 μL， BSA (Takara)0.25 μL，以及模板DNA 1 μL，加滅菌超純水至50 μL。

狼控制區(qū)第一高變區(qū)(HVR Ⅰ)PCR 反應條件為:94 ℃ 預變性4 min; 接下來40個循環(huán)(94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72℃ 45 s)，最后72 ℃ 延伸5 min。Cytb區(qū)PCR反應條件為:94 ℃ 預變性4 min， 接下來40個循環(huán)(94 ℃ 30 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s)，最后72 ℃ 延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收及測序

PCR產(chǎn)物采用1.0%的常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測，上樣量為5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×Loading Buffer(Takara)，100 V電壓電泳30 min,凝膠經(jīng)EB染色后置于紫外下觀察將目的條帶切下，用凝膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit，USA)回收純化后送至北京三博遠志測序公司進行測序。

1.2.4 序列分析

測序所得序列結果在Genbank上經(jīng)Blast比對后確定序列來源于狼。用Clustal X軟件進行DNA序列排列[12]，并輔以人工校對，以去掉擴增的Cytb序列中所包含的線粒體tRNApro序列。基于Kimura雙參數(shù)距離模型(Kimura-2-Parameter，K2P)，通過MEGA 5.0計算各地理種群狼控制區(qū)HVR Ⅰ和Cytb序列變異堿基比例、變異類型、轉換和顛換比(R)及遺傳距離等基礎數(shù)據(jù)[13]。基于狼Cytb序列，利用遺傳距離和分子鐘的分歧時間計算公式為t=D/2a(t為分歧時間，D為遺傳距離，a為分子鐘)并結合已經(jīng)校正的哺乳動物細胞色素b序列的每百萬年2%分子鐘來計算中國各地計算各地理種群進化分歧時間[14-15]。基于狼控制區(qū)HVR Ⅰ序列用DnaSP 5.0[16]軟件劃分單倍型，將單倍型序列上傳至Genbank，單倍型序列登陸號見表4，并計算核苷酸多樣性(Nucleotidediversity，Pi)和單倍型多樣性 (Haplotypediversity,Hd)，進而推算各地種群遺傳多樣性高低。為了研究中國各地狼的系統(tǒng)發(fā)育，結合本研究中發(fā)現(xiàn)的中國狼線粒體HVRⅠ單倍型及從Genbank中下載已有中國狼研究中20個mtDNA控制區(qū)序列，然后重新劃分單倍型，用鄰接法 (Neighbour-joining，NJ)以 Genbank下載的郊狼線粒體控制區(qū)序列(Canis latrans, Genank登錄號：NC_008093)為外群構建單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹，其中各節(jié)點的支持率根據(jù)各序列bootstrap[17]1000次重抽樣后數(shù)據(jù)計算。根據(jù)單倍型變異位點，應用軟件Network 4.610 (http://www.fluxus-engineering.com/sharenet.htm)構建基于Median-Joining法簡約網(wǎng)絡(Statistical parsimony network)關系圖，以期與已有研究進行比較。為了解中國狼在世界范圍內的系統(tǒng)進化地位，下載了123個世界各地狼線粒體控制區(qū)單倍型(附表)，并以8個郊狼單倍型序列(附表)為外群使用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果

2.1 線粒體控制區(qū)HVRⅠ基因序列及其變異

圖1 中國部分地區(qū)狼線粒體第一高變區(qū)多態(tài)位點分布圖Fig.1 Variable sites distribution of HVR Ⅰ in mtDNA of China Wolf

實驗獲得44個中國狼線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)583 bp序列，其中內蒙西旗，內蒙達賚湖自然保護區(qū)，青海湖區(qū)，青海剛察，新疆青河縣樣品全部擴增測序成功(表2)。通過比對44個線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ序列發(fā)現(xiàn)共有變異位點51個，占分析序列長度的8.76%，插入缺失位點11個，堿基替換位點40個(圖1)。研究表明，通過擴增總DNA的方法有可能擴增出核基因組中線粒體基因插入拷貝[18-20]，即線粒體假基因(Numts)。由于線粒體假基因和線粒體基因分歧度較大，這時應考慮青海種群是否存在這樣的假基因。將青海種群線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ基因分別與Genbank中下載先前研究的中國青海狼序列(FJ032363)以及中國內蒙狼序列(GQ374438)比對，發(fā)現(xiàn)青海狼與中國西藏狼序列相似度超過97.5%，而與中國內蒙狼序列比對結果與表4結果相符，證明青海種群確實與其他種群存在較大的分歧。其中轉換/顛換之比R為5.71，說明序列突變未達到飽和狀態(tài)[21]。

各地區(qū)種群的線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ基因堿基組成分析：A，T，C，G平均含量分別是26.29%、30.24%、16.62%和26.85%，其中A+T含量為56.53%，符合脊椎動物線粒體基因組成特點，低于犬科動物線粒體全序列A+T含量(60.3%—60.5%)[22]，表明HVR Ⅰ相對于其他保守的線粒體基因組區(qū)段來說較易突變。

表2 狼樣品測序結果信息表Table 2 The wolf sample sequencing results table

2.2 線粒體Cytb基因序列及其變異

實驗共獲得40個狼線粒體Cytb序列(表2)。將擴增測序所得到40條的長度為767 bp的序列經(jīng)Clustal X[2]比對去掉含有的tRNApro序列后得到582 bp的Cytb部分序列。經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)，沒有發(fā)現(xiàn)堿基插入及缺失現(xiàn)象，表明這些Cytb序列來自于線粒體，而不是核基因中的線粒體假基因[23]。使用MEGA 5.0分析這40條Cytb序列發(fā)現(xiàn)其堿基組成為：T 29.0%、C 29.6%、A 29.9%、G 11.6%。582個堿基位點中共發(fā)現(xiàn)變異位點31個，占分析序列的5.33%，且變異位點全部為簡約信息位點，未發(fā)現(xiàn)單核苷酸變異位點。40個個體總的轉換顛換比(R)為28.68，各地理種群轉換顛換比均大于2.0，與動物線粒體堿基替換模式結論相符[18]。狼Cytb部分序列G+C含量為41.2%，與脊椎動物基因序列G+C含量在40%—50%之間的結論相符[24]。密碼子第一位點G+C含量(50.2%)明顯高于第二位點(40.2%)和第三位點(38.2%)的含量，表明密碼子第二三位點開始傾向于富含AT(表3)。

表3 狼Cyt b部分序列基因密碼子同位點的堿基組成平均值/%Table 3 Base compositions averagement for Cyt b partial sequenees of Wolf in the 1st,2nd,3rd position of the genetic codons

2.3 基于線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ中國部分地區(qū)狼遺傳多樣性分析

使用軟件DnaSP 5.0對44個成功獲得目的個體樣本片段序列進行分析，共確定16個單倍型，其中青海種群內部青海剛察與青海湖區(qū)種群共享3個單倍型(QH2，QH3，QH4),新疆種群內部新疆阿勒泰地區(qū)及青河縣種群共享1個單倍型XJ2，內蒙種群內部內蒙達賴湖自然保護區(qū)，西旗及呼倫貝爾種群共享2個單倍型NM2和NM4，吉林圖門與內蒙呼倫貝爾種群共享1個單倍型NM3(表4)。吉林圖門與內蒙呼倫貝爾種群之間共享1個單倍群，說明兩個種群之間表現(xiàn)為共同的母系來源或存在基因交流。

表4 線粒體控制區(qū)HVRⅠ單倍型及變異位點信息Table 4 Haplotypes and variable sites within the HVR Ⅰ of mitochondrial control region

由于吉林圖門種群數(shù)量小于3，不符合Tajima檢驗[25]要求至少3條同源原序列的要求，所以選取符合條件的青海，內蒙和新疆種群進行遺傳多樣性分析。使用DnaSP 5.0軟件對分布在中國青海、內蒙、新疆3個種群44個個體測得的線粒體控制區(qū)HVR Ⅰ進行遺傳分析后得出，中國種群單倍型多態(tài)性Hd為0.897，核苷酸多態(tài)性Pi為0.02278。新疆種群的核苷酸多樣性為0.942，明顯的高于另外兩個種群，說明新疆種群遺傳多樣性較高，遺傳資源豐富。通過Tajima′s D 和Fu and Li′s D 值檢測結果無顯著差異(P>0.10)表明這3個中國狼種群相對于中性進化的歧異度沒有明顯的偏離(表5)。

表5 中國狼3個地理種群43個糞便樣品線粒體DNA HVR Ⅰ遺傳多樣性分析Table 5 Analysis of the genetic diversity of mitochondrial DNA HVR Ⅰ for 42 individuals in three populations of Chinese wolves

*P>0.10無顯著差異

從Genbank下載的中國各地區(qū)的基于線粒體控制區(qū)序列20個灰狼的線粒體控制區(qū)序列(附表)。由于下載的序列長度存在差異，所以我們將所有序列剪輯后得到長度為582 bp的線粒體控制區(qū)序列?；?82 bp的序列重新劃分中國狼單倍型，發(fā)現(xiàn)28個單倍型，并重新對其進行編號，其中NM2(W2)，NM4 (W4)，QH2 (W7)，QH3 (W8)，QH4 (W9)，XJ3 (W16)與以前研究中發(fā)現(xiàn)的單倍型完全匹配(附表)。

圖2 基于中國狼mtDNA控制區(qū)28單倍型序列構建的NJ樹(a)和基于中國狼mtDNA控制區(qū)28單倍型序列構建的網(wǎng)絡結構圖(b)Fig.2 Neighbor-joining tree of 28 mtDNA haplotypes based on mtDNA D-loop of China wolf (a)and Network of 28 mtDNA haplotypes based on mtDNA D-loop of China wolf (b)圓圈代表的是單倍型，紅點代表的是假定的中間單倍型， 線代表一個替位突變, 圈的大小與單倍型頻率的大小成正比

2.4 分子系統(tǒng)樹的構建

通過對Genbank下載的20條中國狼線粒體控制區(qū)序列與比研究發(fā)現(xiàn)的單倍型對后重新定義28個單倍型。通過比對后發(fā)現(xiàn)本研究發(fā)現(xiàn)的線粒體控制區(qū)單倍型與Tsuda,K等[26]在蒙古烏蘭巴托附近發(fā)現(xiàn)的狼單倍型共享3個單倍型，與羅理楊[7]等發(fā)現(xiàn)的單倍型共享4個單倍型(附表)。使用NJ法構建28個中國狼單倍型系統(tǒng)進化樹(圖2)，除青海種群外，其他地區(qū)或亞地區(qū)的的狼單倍型并沒有聚集在一起，表明地區(qū)或亞地區(qū)狼在遺傳學方面沒有獨特的遺傳結構[7]。通過進化樹不難看出，青海種群單倍型與除青藏高原外的單倍型基于遺傳距離分屬兩個不同的世系，這與羅理楊等所得的結果一致[7]。把得到的28個中國狼單倍型與Genbank上下載的123個灰狼單倍型序列構建NJ樹發(fā)現(xiàn)，位于青藏高原及其周邊地區(qū)的狼與喜馬拉雅山脈西側的印度狼親緣關系較近并為一支，而廣布于中國其他地區(qū)的狼單倍型與歐亞狼親緣關系較近，且沒有表現(xiàn)出明顯的與地理分布有關的差異(圖3)。

圖3 基于從Genbank下載的225bp的線粒體控制區(qū)序列，使用K2P堿基替換模型構建的環(huán)形NJ樹Fig.3 Neighbor-joining original tree, computed using a nucleotide substitution model with Kimura 2 parameter distances, illustrating the phylogenetic relationship among wolf 225bp mtDNA control region haplotypes registered in GenBank

2.5 分化時間估計

基于Cytb序列，利用已經(jīng)校正的哺乳動物細胞色素b序列的每百萬年2%分子鐘來計算中國各地狼進化分歧時間?；贙imura雙參數(shù)距離模型，計算中國各地狼的遺傳距離，其中內蒙、新疆與吉林種群遺傳距離數(shù)值范圍為0.002—0.006 MYA Bp，其種群分歧時間大約為0.05—0.15 MYA Bp。青海狼與本研究其他地理種群遺傳距離較遠，遺傳距離為0.043—0.048，由此得出青海種群與其他地理種群分歧時間大約在1.08—1.2 MYA Bp，巧合的是這與青藏高原受地質作用的急速隆起時間(0.9—1.1 MY)相近[27]。

3 討論

狼分布范圍廣，野外活體采樣難度很大。本文嘗試從糞便中成功的提取總DNA，為今后通過使用糞便樣品對狼進行遺傳進化研究提供了依據(jù)。本研究從55個樣品中成功的提取和擴增出出44個個體的線粒體HVR Ⅰ和40個Cytb序列，其中未成功提取出DNA的樣品全部為糞便樣品，而且主要為內蒙呼倫貝爾地區(qū)樣品。未提取出來的原因可能是采集的糞便樣品時間過長，樣品中的DNA降解或者糞便樣品中含有可抑制后續(xù)反應的酶[28]。

對種群進行遺傳多樣性評估，不僅有利于了解種群結構及動態(tài)，而且為制定種群保護和管理措施提供依據(jù)。通常考慮一個種群遺傳多樣的高低主要是通過對比種群內部單倍型間的遺傳距離和核苷酸多態(tài)性，然而由于核苷酸多態(tài)性充分考慮到了單倍型在種群內的比例，所以一般使用核苷酸多態(tài)性來衡量一個種群遺傳多樣性的高低[29]。本研究利用線粒體HVR Ⅰ序列對中國4個地理狼種群進行遺傳多樣性檢測，發(fā)現(xiàn)平均核苷酸多態(tài)性為2.27%，與世界其他地區(qū)狼相比遺傳多樣性是較高的，如Randi等[30]通過分析mtDNA控制區(qū)序列發(fā)現(xiàn)保加利亞狼核苷酸多樣性為0.26%，Pilot[31]等在東歐十多個國家采集到643只狼樣品，并成功地鑒定出21個線粒體DNA單倍型，得出其核苷酸多樣性為1.7%，Tomislav等[32]分析了91只狼的線粒體控制區(qū)序列得出克羅地亞狼遺傳多樣性為1.8%，從而說明中國狼相對于世界其他國家和地區(qū)來說線粒體D-loop區(qū)存在豐富的多樣性。

通過構建的中國狼分子系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，青海種群與西藏狼明顯的并為一支，而其他地區(qū)的狼則沒有按照地理區(qū)劃分成不同的譜系，同時各個譜系間含有共同的單倍型，說明其遺傳基礎一致，存在著基因交流，這與北美狼亞種分化的研究是一致的[33]。t檢驗也顯示了吉林，內蒙，新疆種群之間的遺傳距離無顯著差異，而與青海種群差異明顯。其中青海種群擁有較多的單倍型，且通過世界狼系統(tǒng)進化樹不難看出，青海種群擁有的單倍型較為特殊，不與除青藏高原及周邊地區(qū)外的中國其他地區(qū)的狼單倍型相似，而是與喜馬拉雅山山脈西部位于印度等國家地區(qū)的狼接近，通過青海種群的分布區(qū)域考慮，青海種群位于青藏高原東北部的青海湖周邊地區(qū)，北面為昆侖山和祁連山，東面為橫斷山脈，平均海拔在3000m以上，山地可以達到4000m以上，這些天然的地理屏障阻礙了青海種群與青藏高原外的其他地理種群進行基因交流，長期的地理隔離造成青海種群獨立進化形成了隔離種群。而青海種群與西藏狼，云南狼共享單倍型，說明了青海種群與西藏云南種群在起源進化上關系比較近。

長久以來，研究認為中國狼只有一個亞種即C.l.Chanco[4-5]。Tsuda K等[26]通過研究狼的3個亞種(C.l.lupus，C.l.pallipesandC.l.Chanco) 發(fā)現(xiàn)中國狼(C.l.Chanco)的線粒體控制區(qū)變異較其他兩個亞種較大,而我們通過對比線粒體控制區(qū)部分序列發(fā)現(xiàn)，除青海地區(qū)序列與另外兩個亞種序列差異較大外，其他地區(qū)種群單倍型與另外兩個亞種差別不大。Ramesh K Aggarwal 等[34]利用Tsuda K 等[26]從蒙古國烏蘭巴托發(fā)現(xiàn)的狼的線粒體單倍型與印度西部喜馬拉雅山脈狼進行比較，得出印度西部喜馬拉雅山脈狼是與蒙古狼是完全不同的，并推測其是世界上最古老的狼世系，這與的研究結果一致。基于線粒體DNA的研究結果，Dinesh等[35]認為可以將位于印度喜馬拉雅山脈附近狼種群從中國狼或蒙古狼亞種(C.l.Chanco)中剝離出來一起劃歸為西藏亞種(C.l.langier)。通過本文研究，并結合以前形態(tài)學及解剖學上的研究結果[36]推測青藏高原種群的狼可能與印度喜馬拉雅山附近的狼同屬于西藏狼亞種(C.l.langier)，當然這只是推測，具體的情況還需要從解剖生理學，基因組學乃至古生物學的證據(jù)來證實。同時通過構建的系統(tǒng)進化樹(圖3)也能看到除青藏高原及周邊地區(qū)的狼外中國其他地區(qū)的狼單倍型廣布于歐亞大陸乃至北美大陸狼分支中，說明這些地區(qū)的狼起源進化關系較為復雜。

4 結論

基于線粒體控制區(qū)部分序列測定及分析，研究結果表明中國狼較世界其他國家地區(qū)擁有較高的遺傳多樣性。系統(tǒng)進化分析表明中國狼可以分為兩個世系，且位于青藏高原及其周邊地區(qū)的狼與中國其他地區(qū)的狼遺傳結構差異較大，且其遺傳多樣性較其他地區(qū)低。推測其在進化上與中國其他地區(qū)狼較早出現(xiàn)分歧，并形成獨立進化種群。利用線粒體Cytb部分序列推算各地理種群的進化分歧時間得出，位于青藏高原種群與其他地理種群分歧時間大約在1.1 MY前，與青藏高原受地質作用急速隆起時間相近。

致謝：中國科學院西北高原生物所、青海動物園、哈爾濱野狼湖狼園、新疆富疆狼園、內蒙古達賚湖自然保護區(qū)提供研究樣品,東北林業(yè)大學高中信教授、曲阜師范大學劉廣帥同學為采集樣品提供指導與幫助，特此致謝。

[1] Wilson D E，Reeder D M. Mammal Species of the World(MSW)： A Taxonomic and Geographic Reference. 3rd ed. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 2005.

[2] 張洪海，張培玉，王振龍，車啟來. 世界狼的分布、種群數(shù)量及保護現(xiàn)狀.曲阜師范大學學報，1999，25(1)：101-103.

[3] Busch R H. The Wolf Almanac. New York: The Lyons Press:1993, 241-241.

[4] Ellerman J R, Morrison-Scott R C.S. Checklist of Palaearctic and Indian Mammals 1758—1960. London: British Museum (Natural History) publications,1951.

[5] Pocock R I. The Fauna of British India, Including Ceylon and Burma, Mammalia(2 vols, Primates and Carnivora Only). London: Taylor and Francis, 1940

[6] 王秀輝，高中信，于學偉，崔巖. 狼亞種分化的RAPD分子證據(jù).東北林業(yè)大學學報，2000，28(5):110-113.

[7] 羅理楊，金煌，楊公社.中國狼的種內系統(tǒng)發(fā)育關系與亞種分化.東北林業(yè)大學學報， 2003，31(5):81-83.

[8] Avis J C，Arnold J，Ball R M，Birmingham E，Lamb T，Nigel J E，Reba C A，Saunders N C． Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematic． Annual Review of Ecology and Systematic，1987,18(1): 489-522．

[9] Kim K S, Lee S E, Jeong H W, Ha J H. The complete nucleotide sequence of the domestic dog (Canis familiars) mitochondrial genome. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1998, 10(2): 210-220.

[10] Lunt D H，Whipple L E，Hyman B C. Mitochondrial DNA variable number tandem repeats(VNTRs): utility and problems in molecular ecology. Molecular Ecology, 1998, 7(11):1441-1455.

[11] ROERDINK A R，ALDSTADT J H． Sensitive method for the determination of roxarsone using solid-phase micro extraction with multi-detector gas chromatography. Journal of Chromatography A, 2004, 1057(1/2): 177-183．

[12] Jeanmougin F，Thompson J D，Gouy M，Higgins D G，Gibson T J． Multiple sequence alignment with Clustal X． Trends in Biochemical Sciences, 1998, 23 (10): 403-405．

[13] Tamura K，Dudley J，Nei M，Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version． Molecular Biology and Evolution, 2007, 24 (8):1596-1599．

[14] Li W H，Gokobori T，Nei M． Pseudogenes as a paradigm of neutral evolution. Nature, 1981, 292(5820): 237-239．

[15] Wayne R K, Geffen E, Girman D J, Koepfli K P, Lau LM, Marshall C R. Molecular systematics of the canidae. Systematic Biology, 1997, 46(4): 622-653.

[16] Librado P，Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 2009, 25 (11): 1451-1452.

[17] Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap．Evolution，1985, 39(4): 783-791．

[18] Irwin D M,Koeher T D, Wilson A C. Evolution of the cytochromeb gene of mammals. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 128-144.

[19] Woischnik M, Moraes C T. Pattern of organization of human mitochondrial pseudogenes in the nuclear genome . Genome Research， 2002， 12 (6): 885-893.

[20] Tourmen Y, Baris O， Dessen P, Jacques C， Malthiery Y, Reynar P. Structure and chromosomal distribution of human mitochondrial pseudogenes. Genomics, 2002， 80 (1): 71-75.

[21] Knight A，Mindell D P. Substitions bias，weighting of DNA sequence evolution，and the phylogenetic positions of Fea′s viper. Systems Biology，1993，42(1): 18-31．

[22] 陳磊，張洪海，馬建章. 蒙古狼線粒體基因組序列分析及其系統(tǒng)發(fā)育地位.生態(tài)學報，2010，30(6)：1463-1471.

[23] Stadelmann B,Jacobs D S,Schoeman C, Ruedi M. Phylogeny of African Myotis bats (Chiroptera, Vespertilionidae) inferred from cytochrome b sequences. Acta Chiropterologica, 2004, 6(2): 177-192.

[24] Sueoka N. On the genetic basis of variation and heterogeneity of DNA base composition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1962, 48(4): 582-592.

[25] Tajima F .Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics，1989,123(3): 585-595.

[26] Tsuda K, Kikkawa Y, Yonekawa H, Tanabe Y. Extensive interbreeding occurred among multiple matriarchial ancestors during the domestication of dogs: evidence from interand intraspecies polymorphisms in the d-loop region of mitochondrial DNA between dogs and wolves. Genes & Genetic System, 1997, 72(4): 229-238.

[27] Sun J, Liu T. Stratigraphic evidence for the uplift of the Tibetan Plateau between ～1.1 and ～0.9 myr ago. Quaternary Resarch，2000，54(3): 309-320.

[28] 劉艷華，張明海. 基于線粒體Cty b 基因的西藏馬鹿種群遺傳多樣性研究.生態(tài)學報，2011，31(7): 1976-1981.

[29] Neigel J E，Avise J C． Application of a random walk model to geographic distributions of animal mitochondrial DNA variation．Geneties，1993，135 (4): 1209-1220．

[30] Randi E, Lucchini V, Christensen M F, Mucci N, Funk S M, Dolf G, Loeschke V. Mitochondrial DNA variability in Italian and East European wolves: detecting the consequences of small population size and hybridization. Conservation Biology, 2000,14(2): 464-473.

[31] Pilot M, Jedrzejewski W, Branicki W, Sidorovich W E, Jedrzejewska B, Stachura K, Funk S M. Ecological factors influence population genetic structure of European grey wolves. Molecular Ecology, 2006,15(14): 4533-4553.

[33] Vila C, Amorim J R, Leonard J A, Posada D, Castroviejo J, Petrucci-Fonseca F, Crandall K A, Ellegren H, Wayne R K. Mitochondrial DNA Phylogeography and Population History of the GreyWolf Canis lupus. Molecular Evolution, 1999, 8(12): 2089-2103.

[34] Aggarwal R K, Ramadevi J, Singh L. Ancient origin and evolution of the Indian wolf: evidence from mitochondrial DNA typing of wolves from Trans-Himalayan region and Pennisular India. Genome Biology, 2003, 4: 6-6.

[35] Sharma D K, Maldonado J E, Jhala Y V, Fleischer R C. Ancient wolf lineages in India. Biology letters, 2004, 271(S3): S1-S4.

[36] Pocock R I, F R S, F Z S. The races of Canis lupus. Proceedings of the Zoological Society of London, 1935, 105(3): 647-686.

Genetic diversity and phylogenetic analysis of wolves from different geographical regions of China

ZHANG Honghai1,*, DOU Hailong1,2, CHEN Lei1, SHA Weilai1, ZHAO Junjie1

1CollegeofLifeScience,QufuNormalUniversity,Qufu273165,China2CollegeofLifeScience,BeijingNormalUniversity,Beijing100875,China

Wolves were once widely distributed throughout China. The number of Chinese wolves has drastically declined in recent years as a result of environmental destruction and habitat loss. At present, wolves in China are mainly distributed in sparsely populated western and northern regions of the country. To protect this species, an understanding of genetic diversity and phylogenetic relationships of wolf populations in China is necessary. In this study, we analyzed the partial mitochondrial DNA (mtDNA) D-loop region and the Cytb(Cytochrome b)gene of wolves originating from four distinct geographical populations in Xinjiang, Qinghai, Inner Mongolia, and Jilin. Using standard molecular biology techniques, we generated sequences of the mtDNA control region hypervariable region I (HVR I) from 44 wolves, and sequences of the Cytbgene from 40 wolves. The resulting 582-bp HVR I sequence alignment contained 51 variable sites, which corresponded to 8.76% polymorphic loci. Similarly, 31 variable sites, all base substitutions, were identified in the aligned Cytbsequence data set. We detected 16 haplotypes among the 44 HVR I gene sequences. The Inner Mongolian population and the population from Jilin were found to share the same HVR I haplotype. When this data set was combined with previously generated Chinese wolf sequences available in Genbank, a total of 28 haplotypes from approximately 91 Chinese wolves were identified. To explore the genetic diversity of these geographic populations, we calculated nucleotide diversity and haplotype diversity from the HVR I sequences. The population from XinJiang was found to have the highest genetic diversity. When we compared these results with previously reported nucleotide diversities of wolves from other countries and regions, we found that Chinese wolves had the highest nucleotide diversity. In the phylogenetic tree generated using the HVR I haplotypes, Chinese wolves are primarily divided into two lineages. The first lineage comprises haplotypes of wolf populations from the Qinghai-Tibet Plateau and surrounding areas. There is no obvious relationship with geographical structure among the remaining wolf haplotype groups. Considering their high level of genetic diversity and restricted geographic distribution, we speculate that the Qinghai-Tibet Plateau populations have evolved in isolation over a long period of time. To investigate the phylogenetic position of Chinese wolves, we downloaded 123 mtDNA partial control region sequences from Genbank, which were obtained from wolves primarily distributed in Eurasia and North America. In the phylogenetic tree generated from these sequences, wolf populations from the Qinghai-Tibet Plateau are clearly separated from wolves from other regions of China. The results of this phylogenetic analysis suggest that wolf populations in the Qinghai-Tibet Plateau of China comprise an ancient lineage that is still extant in these higher elevation regions. Based on genetic distances calculated using Ctybsequence data, we estimate that the two lineages diverged about 1.1 million years ago, corresponding to the time period during which the Qinghai-Tibet Plateau was suddenly uplifted by geological processes. Based on these results, we propose that the wolves of the Qinghai-Tibet Plateau and the widespread wolfCanislupuschancoare not the same subspecies.

wolf; China; genetic diversity; evolution

國家自然科學基金(31172119, 31372220); 山東省自然科學基金(ZR2011CM009, ZR2010CL014); 高等學校博士學科點專項基金(博導類)(20113705110001)

2013-05-22;

日期:2014-04-25

10.5846/stxb201305221141

*通訊作者Corresponding author.E-mail: zhanghonghai67@126.com

張洪海，竇海龍，陳磊，沙未來，趙俊杰.中國狼不同地理種群遺傳多樣性及系統(tǒng)進化分析.生態(tài)學報,2015,35(6):1869-1881.

Zhang H H, Dou H L, Chen L, Sha W L, Zhao J J.Genetic diversity and phylogenetic analysis of wolves from different geographical regions of China.Acta Ecologica Sinica,2015,35(6):1869-1881.