腦卒中后抑郁大鼠額前皮質(zhì)神經(jīng)生長因子的表達變化

王瑋，彭春，李云(大理學院臨床醫(yī)學院，云南大理67000；大理州公安局刑事科學技術(shù)研究所；大理學院附屬醫(yī)院)

腦卒中后抑郁大鼠額前皮質(zhì)神經(jīng)生長因子的表達變化

王瑋1，彭春2，李云3(1大理學院臨床醫(yī)學院，云南大理671000；2大理州公安局刑事科學技術(shù)研究所；3大理學院附屬醫(yī)院)

摘要：目的觀察腦卒中后抑郁(PSD)大鼠額前皮質(zhì)神經(jīng)生長因子(NGF)及其高親和力酪氨酸激酶受體A(TrkA)mRNA的表達變化。方法 將32只健康成年雌性SD大鼠隨機分為正常組、抑郁組、卒中組、PSD組，每組8只。卒中組采用線栓法制備局灶性腦缺血模型；抑郁組采用慢性不可預見的中等應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)法制備大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型；PSD組采用線栓法制備局灶性腦缺血模型，術(shù)后1周加以中等應(yīng)激刺激及孤養(yǎng)方法制備PSD模型。于造模后第29天各組取0.5 cm厚的大腦額前皮質(zhì)約100 mg，采用RT-PCR法檢測額前皮質(zhì)組織NGF及TrkA mRNA的表達。結(jié)果各組額前皮質(zhì)組織中均有NGF、TrkA的表達。PSD組NGF mRNA表達低于正常組(P<0.05)，其余各組相比NGF mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組TrkA mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論PSD大鼠額前皮質(zhì)NGF mRNA的表達減少，可能與PSD發(fā)病有關(guān)。

關(guān)鍵詞：卒中后抑郁；額前皮質(zhì)；神經(jīng)生長因子；酪氨酸激酶受體A

抑郁是腦卒中患者最常見的精神癥狀，據(jù)統(tǒng)計，約33%的卒中患者患有卒中后抑郁(PSD)[1]。PSD不僅影響卒中患者的康復，而且可以顯著降低患者的生活質(zhì)量，增加病死率[2]。研究發(fā)現(xiàn)，卒中病變位置與PSD發(fā)病有關(guān)，左額葉及基底節(jié)區(qū)病變的卒中患者易發(fā)生PSD[3]，且額葉病變患者預后較差[4]。神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，通過與其高親和力受體酪氨酸激酶受體A(TrkA)結(jié)合發(fā)揮細胞學作用，對神經(jīng)元的生長、分化具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥大鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元的NGF mRNA表達降低[5]。目前，對PSD患者額葉NGF的表達變化及兩者的關(guān)系尚不清楚。2010年12月～2011年12月，我們觀察了PSD大鼠額前皮質(zhì)NGF及TrkA的表達變化，探討額前皮質(zhì)NGF及TrkA在PSD發(fā)病機制中的作用。

1材料與方法

1.1材料實驗動物為健康成年雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量200～250 g，清潔級，由昆明醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證：SYXK(滇)2005-0004。Trizol試劑盒；NGF、TrkB、GADPH引物(購于大連寶生物工程公司)；RT-PCR試劑盒(購于Fermentas公司)。實驗過程中對動物的處置符合大理學院附屬醫(yī)院關(guān)于使用實驗動物的倫理學標準。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型建立將32只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、抑郁組、卒中組、PSD組，每組8只。正常組大鼠置于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水。卒中組采用線栓法制備局灶性腦缺血模型，制備后置于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水。抑郁組每籠1只單獨飼養(yǎng)，采用慢性不可預見的中等應(yīng)激刺激(CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法制備慢性應(yīng)激抑郁模型。PSD組采用線栓法制備局灶性腦缺血模型，造模后每籠1只單獨飼養(yǎng)，術(shù)后1周開始采用CUMS及孤養(yǎng)方法制備PSD模型。各組均在相互隔離的環(huán)境下飼養(yǎng)。模型評價：抑郁組、PSD組均在首次CUMS后第1、8、15、22、29天行蔗糖水消耗試驗，正常組、卒中組與其他兩組同時行蔗糖水消耗試驗，測試大鼠快感反應(yīng)評價抑郁情況；腦卒中后第1、3、5天采用Longa 5分法和水平木棒實驗測試腦卒中模型大鼠神經(jīng)功能缺損程度；腦卒中后第1、3、5天采用體質(zhì)量、興趣感、快感、自發(fā)活動和探究性活動減少程度測試大鼠抑郁程度，證實各組均造模成功。

1.2.2額前皮質(zhì)組織NGF及TrkA mRNA表達檢測采用RT-PCR法。造模后第29天各組均采用3.6%水合氯醛腹腔麻醉行開顱手術(shù)分離腦組織，于冠狀面切取0.5 cm厚的大腦額前皮質(zhì)約100 mg。標本用4 ℃預冷的DEPC水沖洗3次，洗去血跡，置EP管中，-80 ℃冰箱保存。采用Trizol試劑盒提取總RNA，在紫外分光光度儀中檢測其濃度和純度，A260/A280值為1.8～2.0。按照試劑盒說明書合成cDNA，起始總RNA樣品均取4 μg。合成的cDNA第一條鏈可直接用于PCR擴增反應(yīng)，按照2×PCR Master Mix Kit試劑盒說明書操作。GenBank里查找NGF、TrkA與內(nèi)參 GADPH的mRNA序列：NGF上游5′-GGCGAATACCTATGTGGG-3′，下游5′-CACTTAATTCCAATCCGTCA-3′，長度370 bp；TrkA上游5′-AGGTGGCTGCTGGTATGGTGT-3′，下游5′-GCTGAACTTGCGGTAGAGGATG-3′，長度218 bp；GADPH上游5′-CCGTATCGGACGCCTGGTTA-3′，下游5′-CAGTGATGGCATGGACTGTGGT-3′，長度512 bp。采用Primer premier5.0軟件設(shè)計引物，由大連寶生物工程公司制備。PCR反應(yīng)條件：預變性94 ℃5 min，變性94 ℃1 min、退火55 ℃1 min、延伸72 ℃1 min共35個循環(huán)，總延伸72 ℃10 min。同樣方法擴增TrkA和內(nèi)參GADPH。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在BIO-GEL凝膠成像儀紫外模式下拍攝凝膠圖片，并用BIO-GEL凝膠分析系統(tǒng)測定各目的基因條帶的光密度值。數(shù)據(jù)校正后求出目的基因與GADPH的比值，作為NGF及TrkA mRNA相對表達量。

2結(jié)果

PSD組NGF mRNA表達低于正常對照組(P<0.05)，其余各組相比NGF mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義。各組TrkA mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖1、表1。

注：1為Marker DL2000，2～5分別為正常組、抑郁組、卒中組及PSD組電泳條帶。

圖1各組額前皮質(zhì)組織NGF、TrkA的表達(RT-PCR法)

3討論

研究證實，腦卒中患者并發(fā)PSD可增加缺血性腦卒中的復發(fā)率。有學者認為應(yīng)將抑郁癥的診治作為腦卒中的二級預防措施之一[6]。目前認為PSD是一種由生物、心理、社會學多因素參與的精神疾病。研究PSD不僅有助于改善卒中患者的預后，且可為研究抑郁癥的病理生理學機制提供新思路。額葉是參與情緒調(diào)節(jié)的邊緣系統(tǒng)—額葉—皮層下結(jié)構(gòu)的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)PSD患者存在較嚴重的額葉萎縮，證實額葉結(jié)構(gòu)及功能異常在PSD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3,4,7]，但具體機制尚不清楚。

表1　各組額前皮質(zhì)組織NGF、TrkA mRNA

注：與正常組比較，*P<0.05。

NGF是一種特異性蛋白質(zhì)分子，主要分布于海馬、大腦皮層、中隔、嗅球及紋狀體中間神經(jīng)元的膽堿能神經(jīng)元[8]。NGF可以促進神經(jīng)元的增殖、分化及損傷后的修復與再生，對維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能具有重要作用，還參與高級神經(jīng)活動如學習、記憶、行為等過程。NGF表達異常可導致神經(jīng)變性疾病及精神疾病(如抑郁癥)的發(fā)生[9,10]。NGF的生物學效應(yīng)需要通過與其高親和力受體TrkA結(jié)合而產(chǎn)生，TrkA廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，當其與NGF結(jié)合后，可激活酪氨酸激酶信號傳遞系統(tǒng)，使含有NGF的小泡經(jīng)軸突逆行轉(zhuǎn)運至細胞體，引起基因表達改變，最終引起神經(jīng)細胞的分化、生長、存活等生物學效應(yīng)。TrkA受體主要分布于基底前腦、海馬、額前皮質(zhì)等幾乎所有膽堿能神經(jīng)元的細胞膜，因此這些區(qū)域的神經(jīng)細胞數(shù)目、分化程度和突觸聯(lián)系均與記憶、情緒等腦功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PSD大鼠腦組織中NGF表達明顯降低，抗抑郁藥物能夠顯著提高PSD大鼠腦組織中NGF的表達[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PSD組大鼠額前皮質(zhì)NGF mRNA的表達低于正常組，提示NGF在PSD的發(fā)病機制中可能發(fā)揮著重要作用，可能是應(yīng)激造成了大鼠額前皮質(zhì)內(nèi)NGF分泌減少，加速了神經(jīng)元的變性和凋亡，最終導致了PSD的發(fā)生；各組額前皮質(zhì)TrkA mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義，提示PSD大鼠額前皮質(zhì)NGF mRNA與TrkA mRNA的表達不一致，可能是由于NGF mRNA在額葉的表達存在自分泌和旁分泌兩種方式[13]，NGF mRNA以旁分泌的形式轉(zhuǎn)移至其他部位。另外，僅從基因水平尚不能代表PSD大鼠額葉NGF與TrkA的表達變化，因為在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平和mRNA水平變化并不一致，對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控不僅局限于轉(zhuǎn)錄過程，翻譯階段也有一部分調(diào)節(jié)作用，因此mRNA水平的變化不能完全反映蛋白質(zhì)水平變化，需要進一步對PSD大鼠額前皮質(zhì)NGF和TrkA蛋白的表達變化進行深入研究。

綜上所述，NGF表達減少可能在PSD的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用，可能是PSD患者預后不良的原因之一。

參考文獻：

[1] Hackett ML, Yapa C, Parag V, et al. Frequency of depression after stroke a systematic review of observational studies[J]. Stroke, 2005, 36(6): 1330-1340.

[2] Bartoli F, Lillia N, Lax A, et al. Depression after stroke and risk of mortality: a systematic review and meta-analysis[J]. Stroke Res Traeat, 2013,2013:862978.

[3] Fang J, Cheng Q. Etiological mechanisms of post-stroke depression: a review[J]. Neurol Res, 2009,31(9):904-909.

[4] Shi YZ, Xiang YT, Wu SL, et al. The relationship between frontal lobe lesions, course of post-stroke depression, and 1-year prognosis in patients with first-ever ischemic stroke[J]. PloS one, 2014,9(7):100456.

[5] 王雪琦,由振東.抑郁癥大鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元NGF含量及其mRNA的表達[J].第二軍醫(yī)大學學報,2002,23(6):590-592.

[6] Sibolt G, Curtze S, Melkas S, et al. Post-stroke depression and depression-executive dysfunction syndrome are associated with recurrence of ischaemic stroke[J]. Cerebrovasc Dis, 2013,36(5-6):336-343.

[7] Tang WK, Chen YK, Lu JY, et al. Frontal lobe atrophy in depression after stroke[J]. Stroke Res Treat, 2013,2013:424769.

[8] 于洋,洪仕君,趙麗萍,等.神經(jīng)生長因子 NGF 的神經(jīng)元保護作用機制及臨床應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J].昆明醫(yī)科大學學報,2014,35(2):148-151.

[9] Chao M, Rajagopal R, Lee F. Neurotrophin signalling in health and disease[J]. Clinical science, 2006,110(2):167-173.

[10] 鄭蕾,王藝明.抑郁癥治療前后血清神經(jīng)生長因子的變化及其影響因素研究[J].重慶醫(yī)學,2013,42(35):4320-4321.

[11] 趙立波,徐露,車坷科,等.氟西汀對卒中后抑郁模型大鼠腦組織中5-HT,NE及NGF表達的影響[J].中國藥房,2013,24(21):1939-1941.

[12] 吳楓,孔令韜,湯艷清.抗抑郁藥物對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)生長因子表達的影響[J].山西醫(yī)藥雜志,2012,41(2):117-120.

[13] Zhang HT, Li LY, Zou XL, et al. Immunohistochemical distribution of NGF, BDNF, NT-3, and NT-4 in adult rhesus monkey brains[J]. Histochem Cytochem, 2007,55(1):1-19.

Expression changes of nerve growth factor in prefrontal cortex of

rat model with post-stroke depression

WANGWei1, PENG Chun, LI Yun

(1AffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali671000,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression changes of nerve growth factor (NGF) mRNA and high affinity tyrosine kinase receptor A(TrkA) mRNA in the prefrontal cortex of rats with post-stroke depression (PSD). MethodsA total of 32 adult female SD rats were randomly divided into the normal control group (n=8), depression group (n=8), stroke group (n=8) and PSD group (n=8). In the stroke group, focal cerebral ischemic rat models were made with suture-occluded method. In the depression group, the chronic stress depression model rats were made by chronic unpredictable medium stress combined with separately breeding. In the PSD group, focal cerebral ischemic rat models were made with suture-occluded method, after postoperative 1 week, PSD rat models were then established by comprehensive separately breeding and moderate stress. Twenty-nine days after modeling, we took 0.5 cm thick frontal cortex (about 100 mg) to detect the NGF and TrkA mRNA expression in the prefrontal cortex tissues. ResultsAll of the groups had the expression of GADPH, NGF and TrkA mRNA in the prefrontal cortex of rats. The gene expression of NGF mRNA in the prefrontal cortex of PSD group was significantly lower than that of the normal control group(P<0.05).Whereas there was no statistical difference among the rest of groups (P>0.05). ConclusionThe reduced expression of NGF mRNA in the prefrontal cortex may be responsible for the pathogenesis of PSD．

Key words:post-stroke depression; prefrontal cortex; nerve growth factor; tyrosine kinase receptor A

(收稿日期：2014-12-07)

通信作者簡介：李云(1975-)，女，副主任醫(yī)師，研究方向為腦血管病與癲癇。E-mail:liyun_neuron@163.com

作者簡介：第一王瑋(1989-)，男，在讀研究生，研究方向為腦血管病與癲癇。E-mail:eettee@163.com

基金項目：云南省科技廳科研基金資助項目(2009ZC126M)。

中圖分類號：R749.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)10-0014-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.005