液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食用油脂中多環(huán)芳烴

石龍凱 劉玉蘭

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocabons，PAHs)是一大類廣泛存在的環(huán)境污染物［1］，并且普遍具有致畸、致癌和致突變作用［2］。由于油料種子的遷移作用以及不當(dāng)?shù)挠椭庸l件致使多環(huán)芳烴可能會(huì)進(jìn)入食用油脂中，對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成損害。歐盟No 835/2011規(guī)定［1］，食用油和脂肪(可可脂和椰子油除外)中苯并(a)芘的限量為不超過(guò)2 μg/kg，苯并(a)蒽、屈、苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘等 4種多環(huán)芳烴(PAH4)的總限量為不超過(guò)10μg/kg。我國(guó)GB2716—2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》僅規(guī)定苯并(a)芘限量為不超過(guò)10μg/kg，對(duì)其它多環(huán)芳烴并未做出限量規(guī)定。根據(jù)多環(huán)芳烴化合物的存在情況及致癌性，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署將16種多環(huán)芳烴化合物列為“優(yōu)先控制污染物”即EPA16，以求更加全面的反映和監(jiān)測(cè)多環(huán)芳烴化合物在環(huán)境及食品中的污染水平。雖然多環(huán)芳烴在食用油脂中的含量極低，然而，鑒于食用油脂在人們每日膳食中的普遍性和必要性，油脂中多環(huán)芳烴的含量水平值得高度關(guān)注并作為監(jiān)控指標(biāo)。

目前，對(duì)油脂中多環(huán)芳烴的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法有GB/T 22509—2008《動(dòng)植物油脂 苯并(a)芘的測(cè)定反相高效液相色譜法》、GB/T 24893—2010《動(dòng)植物油脂多環(huán)芳烴的測(cè)定》(高效液相色譜法)、GB/T 23213—2008《植物油中多環(huán)芳烴的測(cè)定氣相色譜－質(zhì)譜法》等。常用的檢測(cè)方法是HPLC－FLD法［3－5］和 GC －MS法［6－8］。在上述方法中，HPLC 法不能夠?qū)λ械哪繕?biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)樗鼈冎杏行┪镔|(zhì)(如苊烯)的熒光吸收很弱，不能夠用熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量分析。GC－MS法對(duì)某些低分子量熱穩(wěn)定性較差的多環(huán)芳烴檢測(cè)效果較差，且脂類物質(zhì)易在氣相系統(tǒng)的進(jìn)樣口、毛細(xì)管柱及離子源積聚，增加了基線噪音，影響儀器分析性能，同時(shí)，檢測(cè)目標(biāo)物較多時(shí)，單次分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(40～50 min)。劉玉蘭等［9］已經(jīng)建立了一種LC－MS/MS法檢測(cè)食用油脂中苯并(a)芘的快速、靈敏度高的方法，但該方法的研究當(dāng)時(shí)僅針對(duì)苯并(a)芘的檢測(cè)，未涉及食用油脂中其他多環(huán)芳烴成分的檢測(cè)。

本研究建立了一種有機(jī)溶劑萃取、硅膠固相萃取柱凈化、內(nèi)標(biāo)法定量、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS/MS)測(cè)定食用油脂中EPA 16種多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法。與常規(guī)的HPLC－FLD法和GC－MS方法相比，本方法分析時(shí)間短，選擇性以及靈敏度高，適合于食用油脂中多環(huán)芳烴的定量分析，檢測(cè)結(jié)果能更加全面、準(zhǔn)確地反映食用油脂中多環(huán)芳烴各組分的含量水平。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

7類(40份)市售食用油脂:自購(gòu)。包括菜籽油4份、大豆油8份、橄欖油5份、花生油4份、葵花籽油4份、玉米油5份以及芝麻油10份。

EPA 16種多環(huán)芳烴混標(biāo)(200μg/mL，98%，溶解于乙腈):O2si公司;16種氘代同位素內(nèi)標(biāo)(97%):Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司;乙腈、甲苯及環(huán)己烷(色譜純):Sigma公司;硅膠固相萃取小柱:Supelco公司;超純水，Milli－Q超純水機(jī)制取。

1.2 試驗(yàn)儀器

安捷倫1200型液相色譜儀，配有G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G131lA四元混合泵和G1316A柱溫箱:美國(guó)安捷倫公司;API 5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有光電離離子源(APPI)和Analyst 1.5.1軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng):美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;日立L－2130泵:日本日立高新技術(shù)公司。

1.3 分析方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

EPA 16種多環(huán)芳烴混標(biāo)用乙腈稀釋20倍作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，各目標(biāo)物濃度為10μg/mL，工作液由儲(chǔ)備液梯度稀釋獲得，目標(biāo)物最終濃度為100 ng/mL。16種氘代內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解于乙腈，各內(nèi)標(biāo)物濃度為1μg/mL。所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備于棕色瓶中，置于4℃保存。目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍為0.5 ng/mL～1μg/mL之間。按照優(yōu)化的液相和質(zhì)譜條件分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物濃度/內(nèi)標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)物峰面積/內(nèi)標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理

稱取1±0.01 g油脂樣品于15 mL塑料離心管中，加入60μL內(nèi)標(biāo)混合液及8 mL乙腈，以2 000 r/min震蕩9 min，接著以6 000 r/min離心3 min，上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，整個(gè)萃取過(guò)程再重復(fù)1次，合并2次的萃取液。萃取液蒸干后溶解于2 mL環(huán)乙烷，上樣于事先用環(huán)己烷平衡好的硅膠固相萃取小柱。以8 mL環(huán)己烷淋洗小柱，收集上樣液與洗脫液，氮吹至干，復(fù)溶于200μL乙腈，取5μL上樣分析。

1.3.3 回收率和精密度試驗(yàn)

取均一的油脂樣品，分為3組，構(gòu)成高中低3個(gè)加標(biāo)組及1個(gè)空白對(duì)照組。加標(biāo)水平分別為0.05、2、10μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率。以上選取的高中低3個(gè)加標(biāo)水平的油脂樣品，在同一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定其含量5次，計(jì)算日內(nèi)精密度;在連續(xù)6 d內(nèi)每天測(cè)定其含量3次，計(jì)算日間精密度。均以RSD表示。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

色譜條件:液相色譜柱，Agilent Zorbax Eclipse PAH柱(2.1 mm × 100 mm，3.5μm);柱溫箱，25℃;流動(dòng)相A，乙腈;流動(dòng)相 B，水;流速，0.4 mL/min;進(jìn)樣量，5μL;摻雜劑，甲苯;流速，100 μL/min;梯度洗脫，流動(dòng)相 A的比例:0～5 min，45%;5～15 min，45%～100%;15～21 min，100%;21～22 min，100%～45%。

質(zhì)譜條件:離子源電壓800 V;離子源溫度650℃;氣簾氣10 psi;碰撞氣7 psi;霧化氣80 psi;輔助加熱氣60 psi;駐留時(shí)間50 ms;離子模式，正離子模式。16種多環(huán)芳烴及其內(nèi)標(biāo)物離子對(duì)及碰撞能見表1。

表1 EPA 16種多環(huán)芳烴及氘代內(nèi)標(biāo)物的離子對(duì)及碰撞能

1.5 健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)［1］

采用苯并(a)芘的毒性當(dāng)量(toxic equivalent quantity，TEQ)，計(jì)算EPA 16種多環(huán)芳烴的毒性當(dāng)量TEQB(a)P。規(guī)定以苯并(a)芘為標(biāo)準(zhǔn)參考物，其毒性當(dāng)量因子(TEF)值為1，將其它多環(huán)芳與等量的苯并(a)芘對(duì)比毒性大小，得出各個(gè)多環(huán)芳烴的TEF值，TEQB(a)P的計(jì)算公式如下:

式中:Ci為第i個(gè)多環(huán)芳烴的質(zhì)量濃度，ng/kg;TEQB(a)P為基于苯并(a)芘的毒性當(dāng)量，ng/kg;TEFi為第i個(gè)多環(huán)芳烴對(duì)應(yīng)的TEF值。

2 結(jié)果和討論

2.1 方法的線性關(guān)系及檢出限

在選定的色譜和質(zhì)譜分析條件下對(duì)1.3.1中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。線性方程和相關(guān)系數(shù)由analysit 1.5.1軟件給出，所有目標(biāo)物都能保持好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 2～0.999 9。檢出限由3倍信噪比得來(lái)，定量限為10倍信噪比。EPA 16種多環(huán)芳烴檢出限和定量限分別為0.006～0.129μg/kg和0.02～0.43μg/kg。表2給出了EPA 16種多環(huán)芳烴的線性關(guān)系及檢出限和定量限。

2.2 回收率及精密度

在試驗(yàn)方法條件下，EPA 16種多環(huán)芳烴的回收率在86.5%～104.6%，日內(nèi)精密度小于6%，日間精密度小于5%，表明方法對(duì)食用油分析具有良好的精密度和重復(fù)性，具體分析測(cè)定結(jié)果見表3。

表2 EPA 16種多環(huán)芳烴的線性關(guān)系及檢出限和定量限

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用建立的LC－MS/MS檢測(cè)方法，對(duì)所采集的7類(40份)食用油脂中的EPA 16種多環(huán)芳烴的含量進(jìn)行了測(cè)定。油脂樣品中目標(biāo)物色譜圖見圖1?？梢钥闯?，使用建立的前處理方法及分析，油脂樣品中的三酰甘油以及其他干擾物質(zhì)都被很好地去除，色譜柱以及選擇離子的使用能夠使同分異構(gòu)體以及其他共存物很好的基線分離。同時(shí)，氘代內(nèi)標(biāo)的使用，使定量結(jié)果更加可靠。

由表4可知，40份油脂樣品中EPA 16種多環(huán)芳烴的均值為 52.39μg/kg，含量范圍為 11.68～146.06μg/kg。其中輕質(zhì)多環(huán)芳烴是食用油脂中主要的多環(huán)芳烴污染物，占總量的80%以上，均值為43.88μg/kg，范圍為9.67～119.35μg/kg。所有目標(biāo)物中菲的污染程度最高，平均樣本含量為9.95 μg/kg，其次是熒蒽和芘，平均樣本含量分別為5.83 μg/kg和5.01μg/kg。二苯并(a，h)蒽的污染程度最低，平均含量為0.35μg/kg。受測(cè)油樣中，雖然輕質(zhì)多環(huán)芳烴的總量是重質(zhì)多環(huán)芳烴總量的5.3倍，但是重質(zhì)多環(huán)芳烴的TEQB(a)P值卻是輕質(zhì)多環(huán)芳烴的13.1倍。主要原因在于重質(zhì)多環(huán)芳烴的潛在致癌性高于輕質(zhì)多環(huán)芳烴，其TEF值是輕質(zhì)多環(huán)芳烴的100～1 000倍。同時(shí)也說(shuō)明食用油脂中重質(zhì)多環(huán)芳烴的致癌風(fēng)險(xiǎn)更強(qiáng)，對(duì)食用消費(fèi)者的危害性更大。

表3 方法的回收率和精密度/%

圖1 油脂樣品中EPA 16種多環(huán)芳烴色譜圖

苯并(a)芘作為食用油脂的重要衛(wèi)生指標(biāo)，在40份油脂樣品中的平均含量為1.35μg/kg，含量范圍為0.12～4.72μg/kg，低于 GB 2716—2005規(guī)定的10μg/kg限量值。但是在40份油脂樣品中，有8份樣品苯并(a)芘含量高于2μg/kg，按歐盟標(biāo)準(zhǔn)不合格率為20%。有10份樣品的PAH4含量高于10 μg/kg，按歐盟標(biāo)準(zhǔn)不合格率為25%。

表4 40份食用油脂中多環(huán)芳烴的存在情況

由于不同油料的油脂生產(chǎn)工藝不同，成品食用油脂中多環(huán)芳烴的分布情況也有所不同。由表5可知，7類食用油脂中，花生油和芝麻油是多環(huán)芳烴污染較為嚴(yán)重的2類油脂，而大豆油和葵花籽油中多環(huán)芳烴的污染程度最低?？偠喹h(huán)芳烴污染水平為:花生油＞芝麻油＞橄欖油＞菜籽油＞玉米油＞葵花籽油＞大豆油。究其原因，可能是在花生油和芝麻油的生產(chǎn)過(guò)程中，為使產(chǎn)品有濃香風(fēng)味，油籽往往要經(jīng)過(guò)高溫焙炒，過(guò)度的焙炒會(huì)使毛油中多環(huán)芳烴的含量增加。同時(shí)，為了保留在高溫焙炒過(guò)程中產(chǎn)生的香味，濃香型花生油和芝麻油的精煉通常只采用沉降和冷濾，而不經(jīng)過(guò)水化脫膠、堿煉脫酸、吸附脫色和水蒸氣蒸餾脫臭等精煉過(guò)程，這就可能使多環(huán)芳烴因不能被高效脫除而殘存在成品油脂中。菜籽油、大豆油、玉米油、葵花籽油的精煉一般都要經(jīng)過(guò)完整的精煉過(guò)程，因此，這些油的多環(huán)芳烴含量是比較低的。其結(jié)果見表5。

堿煉脫酸、吸附脫色和水蒸氣蒸餾脫臭被公認(rèn)為是脫除多環(huán)芳烴的有效手段［10－11］。劉玉蘭等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，油脂堿煉過(guò)程對(duì)于苯并(a)芘的脫除有一定作用。張小濤等［12－13］研究發(fā)現(xiàn)，油脂的吸附脫色過(guò)程也能脫除苯并(a)芘，活性炭尤其是Norit活性炭對(duì)苯并(a)芘的脫除效果顯著好于活性白土及其他吸附劑。水蒸氣蒸餾脫臭能有效脫除油脂中的輕質(zhì)多環(huán)芳烴［14］。因此，為了降低食用油脂中多環(huán)芳烴的含量水平，合理的制油工藝和完善的精煉工序都是必不可少的。

3 結(jié)論

本研究建立了一種有機(jī)溶劑萃取、硅膠固相萃取柱凈化、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS法)測(cè)定食用油脂中EPA 16種多環(huán)芳烴的檢測(cè)方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，靈敏度高。EPA 16種多環(huán)芳烴的定量限為0.02～0.43μg/kg，平均回收率范圍為86.5%～104.6%。對(duì)40份油樣的檢測(cè)結(jié)果顯示，EPA 16種多環(huán)芳烴的均值為52.39μg/kg，含量范圍為11.68～146.06μg/kg。苯并(a)芘的平均含量為1.35μg/kg，范圍為0.12～4.72μg/kg。對(duì)照我國(guó)GB 2716—2005規(guī)定，所有受測(cè)樣品中苯并(a)芘含量均不超過(guò)≤10μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。但8個(gè)油樣的苯并(a)芘含量超過(guò)了歐盟≤2μg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)，10個(gè)油樣的PAH4含量水平超過(guò)歐盟≤10μg/kg限量標(biāo)準(zhǔn)。輕質(zhì)多環(huán)芳烴的含量(范圍為9.67～119.35μg/kg)遠(yuǎn)高于重質(zhì)多環(huán)芳烴(范圍為1.27～26.71μg/kg)，但重質(zhì)多環(huán)芳烴的潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)更大。多環(huán)芳烴各組分中，菲、熒蒽、芘三者的污染最為嚴(yán)重，二苯并(a，h)蒽的污染水平最低。7類受測(cè)油脂樣品中，EPA 16種多環(huán)芳烴平均含量依次為花生油＞芝麻油＞橄欖油＞菜籽油＞玉米油＞葵花籽油＞大豆油，其差別可能主要與油脂制取和油脂精煉工藝及條件有關(guān)。從總體來(lái)看，雖然食用油中苯并芘含量超標(biāo)率較低，但多環(huán)芳烴總量及風(fēng)險(xiǎn)更應(yīng)受到重視，建議我國(guó)有關(guān)機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食用油中多環(huán)芳烴的檢測(cè)和監(jiān)管力度，規(guī)定多環(huán)芳烴的限量指標(biāo)，確保食用油脂的品質(zhì)安全。

表5 不同種類食用油脂中多環(huán)芳烴的存在情況

［1］宮春波，王朝霞，董峰光，等.食用植物油中多環(huán)芳烴的污染情況及健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)油脂，2013，38(5):75－79

［2］王曉東，王歆睿，李紅，等.氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食用植物油中痕量多環(huán)芳烴［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2013(2):137－140

［3］Purcaro G，Moret S，Conte L S.Rapid SPE － HPLC determination of the 16 European priority polycyclic aromatic hydrocarbons in olive oils［J］.Journal of Separation Science，2008，31(22):3936－3944

［4］Pena T，Pensado L，Casais C，et al.Optimization of a microwave－assisted extraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons from fish samples［J］.Journal of Chromatography A，2006，1121(2):163 －169

［5］Pensado L，Casais M，Mejuto M，et al.Application of matrix solid－phase dispersion in the analysis of priority polycyclic aromatic hydrocarbons in fish samples［J］.Journal of Chromatography A，2005，1077(2):103 －109

［6］Hawthorne SB，Grabanski C B，Martin E，et al.Comparisons of Soxhlet extraction，pressurized liquid extraction，supercritical fluid extraction and subcritical water extraction for environmental solids:recovery，selectivity and effects on sample matrix［J］.Journal of Chromatography A，2000，892(1):421－433

［7］Ong R，Lundstedt S，Haglund P，et al.Pressurised liquid extraction－comprehensive two－dimensional gas chromatography for fast－screening of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil［J］.Journal of Chromatography A，2003，1019(1):221 －232

［8］Martinez E，Gros M，Lacorte S，et al.Simplified procedures for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water，sediments and mussels［J］.Journal of Chromatography A，2004，1047(2):181－188

［9］劉玉蘭，張小濤，趙歡歡.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食用油脂中苯并芘［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械，2012(30):45－48

［10］Balenovic J，Petrovic I，Perkovac M.Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in vegetable oil［J］.Proceeding of Euro Food Chemistry VIII，1995，18 －20

［11］Larsson B，Eriksson A，Cervenka M.Polycyclic aromatic hydrocarbons in crude and deodorized vegetable oils［J］.Journal of the American Oil Chemists’Society，1987，64(3):365－370

［12］張小濤，劉玉蘭，趙歡歡.吸附法同時(shí)脫除菜籽油苯并芘及色澤最佳工藝條件研究［J］.中國(guó)油脂，2013(12):10－14

［13］趙歡歡，劉玉蘭，張小濤，等.吸附法脫除芝麻油中苯并芘及脫色效果研究［J］.糧油食品科技，2013，21(4):23－27

［14］劉玉蘭，汪學(xué)德，馬傳國(guó)，等.油脂制取與加工工藝學(xué)(第二版)［M］.北京:科學(xué)出版社，2009.