金線蓮組培快繁體系優(yōu)化及多糖含量測定

袁小鈴，王建棟，王思雨，張熠玲，劉洪波，邵清松，梅璟妍，王紅珍

(浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江臨安 3 11300)

金線蓮也叫金線蘭，為蘭科開唇蘭屬(Anoectochilus)花葉開唇蘭和金線蘭 (A．formosanus Hayata)的全草。其味甘、性平，具有涼血祛風(fēng)，除濕解毒、強心利尿、固腎平肝等功效，主治腎炎、肺炎、高血壓、糖尿病、高血壓、乙型肝炎等癥［1-2］。在民間有“藥王”或“神草”之稱。金線蓮含有金線蓮苷、黃酮類、多糖、揮發(fā)油、甾體和三萜類化合物、維生素和礦物元素等［1］。其中植物多糖有調(diào)節(jié)免疫能力、抗腫瘤、降血糖、抗衰老、保肝等功效［3］。

金線蓮種子發(fā)芽率低，根系不發(fā)達，再加上各種病原物的侵襲，生態(tài)環(huán)境的破壞和人類的過度采挖，使野生金線蓮資源處于瀕臨枯竭的狀態(tài)。目前常用1～2 cm莖段作為外植體的微扦插法獲得種苗用于人工栽培，因為繁殖系數(shù)低，并不能有效緩解金線蓮原植物資源匱乏的現(xiàn)狀。本文對金線蓮組培快繁技術(shù)進行優(yōu)化，并對多糖含量進行測定，以確定組培苗能否代替微扦插苗作為種苗用于人工栽培，以緩解金線蓮資源匱乏的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花葉開唇蘭 (A．Roxburghii)無菌苗在16 h光照/8 h黑暗和25℃條件下生長至株高5～6 cm。選用不同長度 (帶節(jié)和節(jié)處斷開)的莖段為外植體，接種到不同培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽、生根培養(yǎng)等。

1.2 超聲波輔助法提取金線蓮多糖

用超聲波輔助法提取金線蓮多糖［4］，金線蓮恒溫干燥粉碎后過40目篩，稱取適量粉末，按料液比1∶35加入超純水，60℃超聲30 min，4 200 rpm·min-1離心15 min，收集上清。重復(fù)提取殘渣3次，合并3次提取液。上清中加入活性炭進行脫色處理，抽濾后真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10 mL，加入40 mL無水乙醇，4℃過夜沉淀多糖，離心收集沉淀后溶于40 mL超純水。測定多糖含量，每個樣品重復(fù)3次。

1.3 苯酚-硫酸法測定金線蓮多糖含量

5%苯酚溶液的配制。將苯酚晶體加熱融化，取5 mL苯酚溶液加水定容至100 mL，裝入棕色瓶中避光備用。

葡萄糖溶液的配制。葡萄糖105℃恒溫干燥2 h，冷卻至室溫，配制成濃度為1 mg·mL-1的標準液，4℃保存?zhèn)溆?。分別取標準液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，加蒸餾水至2.0 mL，分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液混勻和濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置10 min，紫外分光光度計測定器490 nm處的吸光度 (D490)。

供試品的配制。量取0.2 mL多糖溶液，加水定容至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液混勻，加濃硫酸5.0 mL，搖勻后室溫放置10 min，測定D490值。

1.4 分析方法

Grubbs檢測 (G=|估計值-平均值|/標準方差)去除與全體觀測值偏離較大的數(shù)據(jù)，當樣品數(shù)為3時，G大于1.155時，去除相應(yīng)的數(shù)值所得［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 金線蓮組培快繁技術(shù)的優(yōu)化

以MS+3%蔗糖+NAA 0.5 mg·L-1+20%香蕉泥+0.9%瓊脂粉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按6-BA終濃度為5.0，4.5，4.0，3.0，2.5，2.0和1.0 mg·L-1加入不同體積的濃度為1 mg·mL-1的母液。在上述培養(yǎng)基上分別接種長度為0.5～1.0 cm莖段(含節(jié))，0.3～0.5莖段 (含節(jié))，0.3～0.5 cm莖段 (節(jié)結(jié)處分開)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6-BA終濃度為4.0，3.0 mg·L-1時的培養(yǎng)基，即6-BA/NAA為8∶1和6∶1時，可誘導(dǎo)3種外植體產(chǎn)生愈傷組織，0.3～0.5 cm莖段 (節(jié)結(jié)處斷開)產(chǎn)生愈傷組織數(shù)目最多。與6-BA/NAA為8∶1的培養(yǎng)基相比，在6-BA/NAA為6∶1培養(yǎng)基上，3種外植體產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)目較高。因此，選用6-BA/NAA為6∶1為誘導(dǎo)愈傷組織的激素配比。

在MS+3%蔗糖 +6-BA 3 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+20%香蕉泥+0.9%瓊脂粉培養(yǎng)基(Ⅰ)中添加3%活性炭，接種0.3～0.5 cm節(jié)結(jié)處斷開的莖段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.3%活性炭的加入對愈傷組織和叢生芽的形成并無明顯促進作用 (圖1中A)，且抑制叢生芽的形成和生長發(fā)育 (圖1中B)。結(jié)果表明，Ⅰ培養(yǎng)基上可產(chǎn)生大量叢生芽(圖1中C)，叢生芽誘導(dǎo)率 (不定芽數(shù)目/外植體數(shù)目)達30%～40%。生根培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.5 mg·L-1NAA+20%香蕉泥+0.9%瓊脂粉。生根苗于泥炭和河沙料中煉苗，并用塑料薄膜覆蓋，15 d后人工種植。

圖1 金線蓮組培快繁體系優(yōu)化

2.2 多糖含量測定

分別吸取 1 mg·mL-1的標準液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，加蒸餾水至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚溶液混勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置10 min［6］，測定 D490值。以標準液濃度為橫坐標，D490值為縱坐標，所得標準曲線為y=26.81x+0.003 5;R2=0.998 5。

組培苗多糖 D490值分別為 0.305，0.309，0.310(表1)，根據(jù)標準曲線計算3個重復(fù)樣品多糖濃度分別為4.50，4.56，4.57 mg·mL-1，平均多糖濃度為4.54 mg·mL-1，栽培苗中多糖含量分別為17.88%，18.21%和16.63%，平均含量為17.57%;微扦插苗多糖 D490值分別為 0.296，0.302，0.280(表2)，計算其多糖濃度分別為4.36，4.45，4.13 mg·mL-1，平均濃度為 4.31 mg·mL-1，微扦插苗多糖含量分別為17.46%，17.53%，16.58%，平均為17.19%。兩者多糖含量無顯著差異。

表1 組培苗和微扦插苗的多糖含量

3 小結(jié)和討論

在MS+3%蔗糖+6-BA 3.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+20%香蕉泥+0.9%瓊脂粉中添加0.3%活性炭對愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽的生長和數(shù)量并無明顯影響，但略為抑制叢生芽的形成和生長，可能是活性炭吸附了培養(yǎng)基中的某些營養(yǎng)成分，導(dǎo)致添加活性炭反而不利于叢生芽的生長發(fā)育。在MS+3%蔗糖+3 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+20%橡膠泥+0.9%瓊脂粉上可形成大量的叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率 (不定芽數(shù)目/外植體數(shù)目)遠高于用莖片和莖段作為外植體誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率［7-9］。說明在節(jié)處斷開的莖段作為外植體，可誘導(dǎo)更多的愈傷組織和叢生芽，可能是因為植物節(jié)部位的居間分生組織在誘導(dǎo)愈傷組織和存生芽的過程中發(fā)揮中一定的作用。

通過優(yōu)化組培快繁技術(shù)，使金線蓮的不定芽/外植體達到30～40，遠高于微扦插不定芽/外植體1～2，極大增強了瀕危金線蓮資源的繁殖系數(shù)，同時，其重要的活性成分，如多糖含量并無明顯差異，因此利用組培苗代微扦插苗作為種苗，是緩解金線蓮資源緊缺的有效途徑。

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［5］ Miller J，Miller J.Statistics and chemometrics for analytical chemistry［M］.6thed.Ontario:Pearson Education Canada Inc，2010..

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