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    大鼠腦出血后活化星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR-JAK1/STAT3表達(dá)及Genistein 的抑制作用

    2015-03-11 08:20:04霖,劉珍,武
    關(guān)鍵詞:星形腦損傷膠質(zhì)

    肖 霖,劉 珍,武 衡

    目前,許多研究認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化在腦出血后腦損傷中可能起著重要的作用,腦損傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞通過自分泌、旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)自身的分裂增殖,其中轉(zhuǎn)化生長因子-α(TNF-α)、表皮生長因子(EGF)是刺激活化AS 進(jìn)入細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子[1],而表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是TNF-α、EGF 兩種配體的共同受體。EGFR 是ErbB(ErbB1-4)家族的一員,是一種跨膜糖蛋白,屬受體型酪氨酸蛋白激酶(RTK),與配體結(jié)合后,受體二聚化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶活化,通過激活下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 通路、PI3K/PDK1/Akt 通路、JAK/STAT 通路)[2]將信息傳遞到核內(nèi),作用靶基因,參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的增殖、分化與遷移。近來有研究發(fā)現(xiàn),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(外傷、卒中、腫瘤)或神經(jīng)系統(tǒng)變性(阿爾茨海默病、帕金森病)[3]等情況下,EGF 及EGFR 在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)迅速上調(diào),并長時(shí)間持續(xù)存在。我們最近的研究也表明,體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)活化后,EGFR mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)[4],表明EGFR 可能介導(dǎo)了星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)的上游信號(hào)調(diào)控分子。而JAK/STAT 通路是EGFR 下游信號(hào)傳導(dǎo)通路之一,基于此,我們選擇染料木黃酮(genistein,GST)特異地抑制酪氨酸激酶活性[5],通過抑制EGFR 表達(dá),進(jìn)一步抑制其下游信號(hào)系統(tǒng)的激活,從而抑制細(xì)胞生長,為腦損傷后干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化提供新的藥效學(xué)靶點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 體重200~300 g SD大鼠60 只(南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部購買),雌雄各半。鼠腦立體定位儀;常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 大鼠腦出血模型制作 大鼠以10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,固定于鼠腦立體定位儀,參照鼠腦立體定位儀圖譜,確定進(jìn)針的部位:以前囟為原點(diǎn),向后1.4 mm,矢狀縫右側(cè)旁開3.2 mm,開一約2 mm×2 mm 大小的正方形骨窗,通過微量注射器向下進(jìn)針5.6 mm,緩慢注入0.20 U/μl的Ⅶ型膠原酶2 μl。神經(jīng)功能評(píng)分采用Bederson 5 分制評(píng)分法:無神經(jīng)功能缺失癥狀0 分;提尾時(shí)損傷對(duì)側(cè)前肢屈曲1 分;前肢屈曲及對(duì)側(cè)抵抗推力下降2 分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈3 分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識(shí)障礙4 分。1~3 分為造模成功大鼠。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 造模后大鼠隨機(jī)分為3 組(每組20 只),腦出血模型組(ICH 組):造模后大鼠正常飼養(yǎng),自由飲水;GST 組:造模后腹腔注射7.5 g/L 濃度Genistein(劑量50 mg/kg),1 d 一次;DMSO 組:造模后每天腹腔注射相同劑量DMSO 溶液。每組大鼠分別于術(shù)后1 d、7 d、14 d 和28 d 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理,各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5 只大鼠。

    1.4 組織處理 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,打開胸腔,充分暴露心臟,經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈,用血管鉗鉗夾腹主動(dòng)脈,剪開右心耳,經(jīng)左心室快速灌入生理鹽水100~150 ml 左右,當(dāng)右心耳流出液變清亮?xí)r,再用4%多聚甲約200 ml 灌注固定,然后取腦組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固體過夜后包埋成蠟塊,切片備用。

    1.5 GFAP、EGFR 免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)采用SABC 法,對(duì)照組用PBS 代替一抗。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)不同的視野,用Quantimet570 圖像分析系統(tǒng)Quic 圖像分析軟件進(jìn)行分析,測定陽性細(xì)胞的平均吸光度值(A 值)。

    1.6 Western blot 法檢測p-JAK1 及p-STAT3提取各組腦組織總蛋白,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,10%脫脂奶粉封閉后,加入一抗、二抗孵育,最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行底物顯色。使用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描,以p-JAK1/p-STAT3 與βactin 灰度值的比值進(jìn)行比較分析。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,同一時(shí)間點(diǎn)組間及不同時(shí)間點(diǎn)組內(nèi)的比較采用方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 3 組大鼠在腦出血術(shù)后1 d,神經(jīng)功能評(píng)分無明顯差異(P>0.05);第7、14、28 天,GST 組與ICH 組、DMSO 組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DMSO 組與ICH組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);GST 組的第7、14、28 天與第1 天比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);DMSO 組、ICH 組第7、14 天與第1 天比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);第28 天與第1 天比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

    2.2 各組大鼠GFAP、EGFR 表達(dá)的比較 腦出血后第1、7,14、28 天均可見GFAP、EGFR 陽性表達(dá),腦出血后第1、7 天,ICH 組、DMSO 組及GST 組GFAP、EGFR 陽性表達(dá)無明顯差異(P>0.05),第14、28 天,GST 組GFAP、EGFR 陽性細(xì)胞明顯增多,與ICH 組、DMSO 組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各時(shí)間點(diǎn)DMSO 組陽性細(xì)胞表達(dá)與ICH 組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表2)。

    2.3 各組p-JAK1、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平比較 腦出血后,大鼠腦內(nèi)p-JAK1、p-STAT3 表達(dá)水平明顯上調(diào),7 d 達(dá)高峰(見圖1),14 d 開始下降,28 d仍有少量表達(dá)。第7 天GST 組p-JAK1、p-STAT3 水平較ICH 組、DMSO 組明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2),其余時(shí)間點(diǎn),各組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(n=20,±s)

    表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(n=20,±s)

    與同時(shí)間點(diǎn)ICH、DMSO 組比較* P<0.05;與同組1 d 比較#P<0.05

    表2 各組大鼠GFAP、EGFR 陽性表達(dá)平均吸光度值(A 值)比較(n=20,±s)

    表2 各組大鼠GFAP、EGFR 陽性表達(dá)平均吸光度值(A 值)比較(n=20,±s)

    與同時(shí)間點(diǎn)ICH、DMSO 組比較* P>0.05;與同時(shí)間點(diǎn)ICH、DMSO 組比較#P<0.05

    圖1 各組第7 天p-JAK1、p-STAT3 蛋白表達(dá)

    圖2 各組第7 天p-JAK1、p-STAT3 表達(dá)

    3 討論

    在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元起結(jié)構(gòu)支持作用。正常情況下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞存在靜止態(tài)、活化態(tài)兩種并存細(xì)胞形態(tài),但在病理?xiàng)l件下(出血、梗死、外傷等),大量星形膠質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下,從靜息狀態(tài)快速向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后,其在不同時(shí)期對(duì)腦損傷起著截然不同的作用,在病變?cè)缙?,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子與增殖細(xì)胞一起,將損傷區(qū)與非損傷區(qū)隔離,避免膠質(zhì)活化瀑布效應(yīng)造成進(jìn)一步的損傷[6]。但在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖晚期,早期的多種有益功能逐漸消失,反而分泌許多有害因子,形成化學(xué)屏障,影響神經(jīng)再生,同時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增生形成的膠質(zhì)瘢痕可形成機(jī)械性屏障,阻礙軸突的再生、延長和融合[7],并且膠質(zhì)瘢痕可以形成微血管套,壓迫微血管,影響局部的血液供應(yīng)。因此,探討星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化機(jī)制、功能及調(diào)控因素,對(duì)于調(diào)控腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,減少膠質(zhì)瘢痕的形成,促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要的意義。

    腦損傷后,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是損傷刺激通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),由細(xì)胞外通過細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)傳遞到細(xì)胞核,導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)蛋白(如細(xì)胞周期蛋白cyclinsD1)等表達(dá)增高,從而啟動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程,促使細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞不斷增殖活化,到后期形成膠質(zhì)瘢痕,影響神經(jīng)功能的恢復(fù)[7]。研究表明,大鼠腦缺血后,活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在EGFR 表達(dá)上調(diào),而且隨著時(shí)間的遞進(jìn)其陽性表達(dá)值迅速上調(diào),阻斷EGFR 的表達(dá)可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,達(dá)到保護(hù)缺血性腦損傷作用,表明EGFR 可能是腦損傷后促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化重要因素。本研究發(fā)現(xiàn),腦出血后第7天,腦組織中出現(xiàn)明顯的EGFR 陽性表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞,第14、28 天仍可見EGFR 陽性表達(dá)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),EGFR 陽性表達(dá)與GFAP 陽性表達(dá)值成正相關(guān)性變化,予以GST 阻斷EGFR 表達(dá)后,能明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化,表明EGFR 參與了腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化進(jìn)程。

    那么EGFR 是通過何種下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的呢?目前,EGFR-JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與腫瘤細(xì)胞的增生關(guān)系已經(jīng)明確,那么,我們是否可借鑒而用于研究其是否與星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖有關(guān)呢?目前尚無此方面的研究。不過,近來已有許多研究表明JAK 及STAT 家族成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和損傷修復(fù)過程中存在不同程度的表達(dá)[8]。JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究,以往主要集中在神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域,與膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系是最近才為人們所認(rèn)識(shí),而且主要集中在小膠質(zhì)細(xì)胞,如腦缺血可使小膠質(zhì)細(xì)胞的JAK/STAT 信號(hào)傳導(dǎo)途徑活化,在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖中的作用目前不清楚。JAK-STAT 途徑主要是各種細(xì)胞因子與受體結(jié)合,使其二聚體化,JAK 相互靠近、磷酸化,使受體上的酪氨酸殘基磷酸化,通過STAT 形成二聚體后,STAT 與受體分離,轉(zhuǎn)位到核內(nèi),結(jié)合到DNA 序列,從而調(diào)控基因表達(dá)。目前,已知AS 上有眾多細(xì)胞因子(如IL-1、IL-6、EGF、TNF-α等)的靶點(diǎn),所以,我們推測當(dāng)這些細(xì)胞因子與AS 上的受體結(jié)合后,可激活JAK/STAT 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,而STAT3 在GFAP 啟動(dòng)子上有結(jié)合位點(diǎn),激活后進(jìn)入核內(nèi)與其位點(diǎn)結(jié)合,引起酪氨酸的快速磷酸化和AS中STAT-3 的核轉(zhuǎn)位,從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增生[9]。本實(shí)驗(yàn)顯示,腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞中EGFR 表達(dá)上調(diào),p-JAK1、p-STAT3 蛋白表達(dá)水平也上調(diào),代表星形膠質(zhì)細(xì)胞的應(yīng)激性反應(yīng)的GFAP 表達(dá)值也相應(yīng)上調(diào),表明腦出血后,活化的EGFR 經(jīng)下游信號(hào)JAK1/STAT3 通路,誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖,從而發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)功能的損傷作用。在給予EGFR 阻斷劑干預(yù)后,GFAP表達(dá)值、p-JAK1、p-STAT3 蛋白水平均受到抑制,神經(jīng)功能恢復(fù),由此提示EGFR-JAK1/STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在大鼠腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞化中發(fā)揮重要作用。

    [1]Shim YJ,Shin YJ,Jeong SY,et al.Epidermal growth factor receptor is involved in clusterin-induced astrocyte proliferation[J].Neuroreport,2009,20(4):435-439.

    [2]Departamento de D,F(xiàn)acultad de M,Pontificia U,et al.Epidermal growth factor receptor(EGFR)and squamous cell carcinoma of the skin:molecular bases for EGFR-targeted therapy[J].Pathol Res Pract,2011,207(6):337-342.

    [3]Yang Q,Wang EY,Huang XJ,et al.Blocking epidermal growth factor receptor attenuates reactive astrogliosis through inhibiting cell cycle progression and protects against ischemic brain injury in rats[J].Neurochem,2011,119(3):644-653.

    [4]郭志慧,武 衡.星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與表皮生長因子受體表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2010,26(8):683-685.

    [5]Lin AH,Leung GP,Leung SW,et al.Genistein enhances relaxation of the spontaneously hypertensive rat aorta by transactivation of epidermal growth factor receptor following binding to membrane estrogen receptors-α and activation of a G protein-coupled,endothelial nitric oxide synthase-dependent pathway[J].Pharmacol Res,2011,63(3):181-189.

    [6]Milos P,Marcela P.Astrocyte reactivity and reactive astrogliosis:costs and benefits[J].Physiol Rev,2014,94(10):1077-1098.

    [7]Yang Q,Wang EY,Huang XJ,et al.Blocking epidermal growth factor receptor attenuates reactive astrogliosis through inhibiting cell cycle progression and protects against ischemic brain injury in rats[J].Neurochem,2011,119(3):644-653.

    [8]Liu YD,Holdbrooks AT,Patrizia DS,et al.Therapeutic efficacy of suppressing the JAK/STAT pathway in multiple models of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2014,192(1):59-72.

    [9]Lucile BH,Ceyzeriat K,Carrillo-de Sauvage MA,et al.The JAK/STAT3 pathway is a common inducer of astrocyte reactivity in Alzheimer’s and Huntington’s diseases[J].J Neurosci,2015,35(2):2817-2829.

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