玻璃化冷凍及程序冷凍對人卵巢組織卵泡活性的影響

劉麗英　曲文玉　蔣麗　張曉麗　劉曉莉　孔剛

(遼寧省沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心，遼寧沈陽　110014)

?

·論著·

玻璃化冷凍及程序冷凍對人卵巢組織卵泡活性的影響

劉麗英曲文玉蔣麗張曉麗劉曉莉孔剛

(遼寧省沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖中心，遼寧沈陽110014)

摘要目的：比較玻璃化冷凍及程序冷凍對人卵巢組織卵泡活性的影響。方法： 將15例人卵巢組織20 min內(nèi)運至實驗室，切割成1 mm×5 mm×5 mm大小的卵巢皮質(zhì)片，隨機分為新鮮組、玻璃化冷凍組及程序冷凍組。玻璃化冷凍組及程序冷凍組均采用優(yōu)化的實驗方法進行。新鮮及復蘇組織體外培養(yǎng)后，在光鏡及電鏡下分析卵泡的形態(tài)正常率，采用激素釋放試驗及異體移植試驗檢測冷凍復蘇的人卵巢組織的功能，并與新鮮組比較。結(jié)果：冷凍復蘇組及新鮮對照組卵巢組織皮質(zhì)內(nèi)均可見形態(tài)正常和異常的始基及初級卵泡，新鮮對照組卵泡形態(tài)正常率顯著高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組(P<0.05)；程序冷凍組形態(tài)正常率稍高于玻璃化冷凍組(P>0.05)。3組均可見超微結(jié)構(gòu)正常及異常的原始卵泡、初級卵泡。卵巢皮質(zhì)片體外培養(yǎng)后持續(xù)分泌雌二醇和孕酮。新鮮組激素分泌水平高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。異體移植試驗顯示，程序冷凍組較玻璃化冷凍組具有更高的移植物回收數(shù)及卵泡密度。結(jié)論：由于程序冷凍人卵巢組織卵泡具有較高的發(fā)育潛能，因此其較玻璃化冷凍更有應用前景。

關(guān)鍵詞玻璃化冷凍；程序冷凍；人卵巢組織；激素釋放試驗；超微結(jié)構(gòu)；移植

基本項目：遼寧省沈陽市科學技術(shù)委員會基金項目(編號：F14-158-9-13)通訊作者

劉麗英，E-mail: llying007@sohu.com

近年來，人卵巢組織冷凍復蘇技術(shù)的臨床應用已經(jīng)取得巨大進展，全球已有十余例活嬰出生[1-2]。研究[3]表明，卵巢組織冷凍保存是保存女性生育能力和內(nèi)分泌功能的有效方法。卵巢組織冷凍不延誤癌癥患者的最佳治療時機、不需要復雜的促排卵及取卵過程，是青春期前及年輕女性患者保存生育能力的最佳方法[4]。目前用于卵巢組織冷凍的方法主要有玻璃化冷凍和程序冷凍。有研究[5-6]比較了這2種方法的冷凍效果，所得出的結(jié)論有所不同。本研究旨在比較玻璃化冷凍及程序冷凍對人卵巢組織卵泡活性的影響。

1資料與方法

1.1標本來源卵巢組織來源于遼寧省沈陽市婦嬰醫(yī)院婦科2013年6月—2014年7月因卵巢良性腫瘤需行腹腔鏡或手術(shù)切除的15例患者，術(shù)后病理證實為卵巢良性腫瘤。15例患者年齡為25～35歲，平均(30.8±2.2)歲；且近半年無服用激素藥物史，具有內(nèi)分泌功能，術(shù)前至少3個月未進行過放療和(或)化療。收集病理檢查證實的正常卵巢組織。本研究經(jīng)遼寧省沈陽市婦嬰醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2卵巢組織的制備將術(shù)中取出的卵巢組織置于裝有預冷卵泡沖洗液(G-mops Vireolife)的無菌試管內(nèi)，置于冰上，20 min內(nèi)送實驗室，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗卵巢組織3次，用刀片切除髓質(zhì)部分，僅保留卵巢皮質(zhì)，切割成1 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊，整個切割過程在15 min內(nèi)完成。將每例患者的卵巢組織均隨機分為3組：新鮮對照組、玻璃化冷凍組及程序冷凍組。

1.3卵巢組織的冷凍與解凍

1.3.1玻璃化冷凍冷凍：卵巢皮質(zhì)片在冷凍基礎(chǔ)液[PBS+10%人血清白蛋白(HSA)]中平衡5 min后，轉(zhuǎn)入冷凍液VS1[0.35 mol/L 二甲基亞砜(DMSO)、0.38 mol/L 丙二醇(PROH)、0.38 mol/L 乙二醇(EG)、冷凍基礎(chǔ)液]5 min，VS2(0.7 mol/L DMSO、0.75 mol/L PROH、0.75 mol/L EG、冷凍基礎(chǔ)液)5 min ，VS3[1.4 mol/L DMSO、1.5 mol/L PROH、1.5 mol/L EG、質(zhì)量體積比(W/V)10% 的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、冷凍基礎(chǔ)液]5 min，VS1及VS2均在室溫下輕輕震蕩平衡，VS3在4 ℃條件下平衡，采用堅硬表面玻璃化冷凍法冷凍。復溫：37 ℃解凍，依次經(jīng)過解凍液1、2、3、4(解凍液1：0.5 mol/L蔗糖(S)、PBS、10% HSA；解凍液2：0.25 mol/L S、PBS、10% HSA；解凍液3：0.125 mol/L S、PBS、10% HSA；解凍液4：PBS、10%HSA)，各5 min，室溫輕輕震蕩，去除冷凍保護劑。

1.3.2程序冷凍冷凍：卵巢組織裝入含6 mL卵巢冷凍液的15 mL試管中(含10%胎牛血清、1.5 mol/L EG、0.1 mol/L S的PBS)，于4 ℃搖床平衡30 min，裝入1.8 mL的細胞凍存管，置于Planner程序降溫儀中。-2～-9 ℃，2 ℃/min；-9～-40 ℃，0.3 ℃/min；-40～-140 ℃，10 ℃/min；-9 ℃植冰，冷凍曲線保存于計算機中，凍存管轉(zhuǎn)移至液氮保存。解凍：37 ℃水浴，直至凍存管中的冰晶全部溶解，卵巢皮質(zhì)片依次經(jīng)過解凍液1、2、3(解凍液1：含0.75 mol/L EG，0.25 mol/L蛋白S；解凍液2：含0.25 mol/L S；解凍液3：PBS)各10 min，室溫輕輕震蕩，去除冷凍保護劑。

1.4體外培養(yǎng)將新鮮及解凍的卵巢皮質(zhì)片轉(zhuǎn)移到含有2 mL卵泡培養(yǎng)液[含1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(Its)、100 U/L的卵泡刺激素(FSH)、10 U/L的黃體生成素(LH)、5%胎牛血清(FCS)的α-MEM]的35 mm培養(yǎng)皿中，37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，隔日換液，收集培養(yǎng)液，凍于-80 ℃冰箱中待用。培養(yǎng)12 d后收集培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)片用于組織學鑒定。

1.5組織學鑒定

1.5.1光鏡分析冷凍復蘇卵泡的組織學結(jié)構(gòu)將所有新鮮和冷凍復蘇后培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)片在4%多聚甲醛固定24 h，然后進行脫水、二甲苯透明、乙醇逐級脫水和石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚5 μm。用切片進行常規(guī)HE染色，樹膠封片。為避免卵泡的重復計數(shù)，每10張連續(xù)片計數(shù)1次。按照Gougeon等[7]的標準觀察卵泡形態(tài)，計數(shù)形態(tài)正常及異常的卵泡。

1.5.2透射電鏡觀察冷凍復蘇卵泡的超微結(jié)構(gòu)新鮮及冷凍復蘇后培養(yǎng)的卵巢皮質(zhì)片置于2.5%的戊二醛中固定，包埋修塊后切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位組織學形態(tài)正常的卵泡，用鉆石刀進行超薄切片后經(jīng)醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色，在透射電鏡下觀察卵泡超微結(jié)構(gòu)。

1.6激素釋放試驗解凍冷凍保存的培養(yǎng)液，采用電化學發(fā)光免疫分析法測定雌二醇(E2)及孕酮(P)水平，E2的敏感性為5.0 μg/L，P的敏感性為0.1 ng/mL。

1.7卵巢組織植入裸鼠體內(nèi)8周齡SPF級性成熟雌性裸鼠(SCID)30只，體質(zhì)量21～26 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將30只裸鼠隨機分為新鮮組、玻璃化冷凍組、程序冷凍組，每組10只。腹腔注射氯胺酮75 mL/kg麻醉小鼠；75%乙醇消毒裸鼠腹部皮膚，剪開腹部皮膚，分離腹部皮下組織，將待移植的卵巢皮質(zhì)片切割成1 mm×1 mm×1 mm大小，用眼科鑷夾取卵巢組織塊并將其多點移植于腹部皮下，縫合皮膚、標記并再次消毒。移植1個月后取出移植物，進行組織學評價。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。樣本率的比較采用Fisher's確切概率法或χ2檢驗。以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1光鏡分析結(jié)果本研究主要對原始卵泡及初級卵泡進行分析，因其他發(fā)育階段的卵泡數(shù)目較少。形態(tài)正常的卵泡表現(xiàn)為圓形卵泡、卵母細胞，顆粒細胞分布均勻，基底膜完整。如果卵泡與卵母細胞形態(tài)不規(guī)則，顆粒細胞不完整，出現(xiàn)核固縮，則為形態(tài)異常的卵泡。冷凍復蘇組及新鮮組卵巢組織皮質(zhì)內(nèi)均可見形態(tài)正常和異常的始基卵泡及初級卵泡，見圖1。新鮮組卵泡形態(tài)正常率顯著高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組(P<0.05)，程序冷凍組形態(tài)正常率稍高于玻璃化冷凍組(P>0.05)。見表1。

A：形態(tài)正常的始基卵泡、初級卵泡；B：形態(tài)異常的始基卵泡、初級卵泡、卵母細胞皺縮

圖1　光鏡下觀察人卵泡的形態(tài)(HE染色，×200)

注：與其他2組比較，*P<0.05

2.2透射電鏡分析結(jié)果3組中均可見超微結(jié)構(gòu)正常的原始卵泡、初級卵泡。卵母細胞居中、圓形，核膜及核仁清晰完整，卵母細胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜完整，顆粒細胞膜完整，排列整齊，細胞間連接緊密，細胞核完整，染色質(zhì)分布均勻。冷凍標本中可見部分卵子的胞核及胞漿模糊，不能清晰辨認內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，線粒體腫脹，基質(zhì)暗淡，個別卵母細胞及顆粒細胞胞漿中無細胞器區(qū)和空泡增多。見圖2。

2.3激素釋放試驗卵巢皮質(zhì)片體外培養(yǎng)后持續(xù)分泌E2和P，新鮮組激素分泌水平高于玻璃化冷凍組和程序冷凍組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

A：正常原始卵泡：卵母細胞核規(guī)整，有明顯的核仁及異染色質(zhì)，胞漿內(nèi)細胞器豐富；B：異常的初級卵泡：胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡(#)及無細胞器區(qū)(*)，顆粒細胞內(nèi)出現(xiàn)大量無細胞器區(qū)域(+++)

圖2透射電鏡下觀察人卵泡的形態(tài)(×30 000)

圖3　新鮮及冷凍復蘇卵巢組織經(jīng)體外培養(yǎng)后E2及P值的變化

2.4卵巢組織異體移植結(jié)果解剖裸鼠后尋找移植物。30只裸鼠中25只找到移植物，其余5只移植失敗，僅見很小的纖維化結(jié)節(jié)。組織學檢測顯示移植物已有新生血管生成，可見不同發(fā)育階段的卵泡。新鮮組移植效果最好，15個移植物中共見36個卵泡；程序冷凍組12個移植物中共見25個卵泡；玻璃化冷凍組移植效果較差，8個移植物中共見13個卵泡。見圖4。

圖4　經(jīng)冷凍復蘇異體移植后卵巢組織的組織學檢測結(jié)果

3討論

程序冷凍是傳統(tǒng)的冷凍方法，目前已經(jīng)廣泛應用于卵巢組織的冷凍。該方法應用低濃度冷凍保護劑，使其在緩慢降溫過程中脫水，避免細胞內(nèi)冰晶形成。冷凍保護劑的類型及濃度是影響冷凍保存效果的重要因素。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，采用EG(1.5 mol/L)的冷凍效果最好，因此，本研究亦采用EG(1.5 mol/L)作冷凍保護劑。

玻璃化冷凍是近年來新發(fā)展起來的冷凍保存技術(shù)。該方法應用的高濃度冷凍保護劑能充分滲透至細胞內(nèi)，經(jīng)過快速降溫，使細胞內(nèi)外的液態(tài)直接轉(zhuǎn)化成黏稠、無結(jié)構(gòu)的非晶體玻璃化狀態(tài)，從而最大限度地降低了細胞內(nèi)冰晶的形成，減輕了對細胞的冷凍損傷。Vajta等[8]研究認為，玻璃化冷凍比慢速冷凍更為有效和可靠，是未來冷凍技術(shù)的發(fā)展方向。

目前已有多項研究比較了玻璃化冷凍及程序冷凍的效果，但得出的結(jié)論不同。2004年Rahimi等[5]對人卵巢組織玻璃化及程序冷凍進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冷凍效果的差異無統(tǒng)計學意義。2006年Gandolfi等[6]對人、牛及豬的卵巢組織進行了玻璃化冷凍及程序冷凍，得出的結(jié)論是，慢速冷凍能夠更好地保存卵泡中的各種細胞。2007年Li等[9]對玻璃化冷凍及程序冷凍的研究中，第1組采用2.5 mol/L DMSO+2.5 mol/L 丙二醇+0.2 mol/L蔗糖作為冷凍保護劑直接投入液氮的玻璃化冷凍方法；第2組采用1.5 mol/L DMSO+0.1 mol/L蔗糖的程序冷凍方法；培養(yǎng)2周后檢測正常卵泡的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組效果差異無統(tǒng)計學意義。Isachenko 等[10]2007年應用Li等[9]的玻璃化冷凍方法檢測玻璃化冷凍的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)程序冷凍的卵泡質(zhì)量更好。隨后，玻璃化冷凍的方法得到優(yōu)化，經(jīng)冷凍復蘇、培養(yǎng)后可獲得較高質(zhì)量的卵泡[11]。2009年，Isachenko等[12]將優(yōu)化的玻璃化冷凍方案與程序冷凍法進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2種方法冷凍的卵巢組織在形態(tài)及內(nèi)分泌功能方面差異無統(tǒng)計學意義，但在分子生物學水平差異有統(tǒng)計學意義，玻璃冷凍組有大量的完整RNA的降解[12]。他們的結(jié)論是，程序化冷凍具有更好的發(fā)育潛能，更有應用前景。2009年Keros等[13]對2種程序冷凍法以及2種玻璃化冷凍法進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應用PROH、EG、DMSO和PVP的玻璃化冷凍方案可更好地保持卵泡完整性。堅硬表面玻璃化法(SSV)是將含有卵巢組織的液滴直接滴到在液氮中預冷的固體表面，進行玻璃化冷凍。一些學者[14-15]采用SSV作為載體對卵巢組織進行玻璃化冷凍，發(fā)現(xiàn)復蘇后卵泡的活力優(yōu)于傳統(tǒng)玻璃化冷凍法。因此本研究采用Keros等[13]的玻璃化冷凍法，采用SSV作為冷凍載體進行玻璃化冷凍。

本研究采用玻璃化冷凍及程序冷凍法冷凍人卵巢組織，觀察新鮮卵巢組織與冷凍復蘇卵巢組織的形態(tài)。結(jié)果顯示，經(jīng)過冷凍后，2種方法復蘇的卵巢組織的卵泡形態(tài)正常率均低于新鮮組織，差異有統(tǒng)計學意義，可見在冷凍和復蘇過程中人卵巢組織受到一定的損傷。程序冷凍卵巢組織的形態(tài)正常率稍高于玻璃化冷凍組，但差異不顯著。程序冷凍組始基卵泡的形態(tài)正常率比初級卵泡高，這可能是由于始基卵泡的體積小，代謝率低、缺少細胞器及皮質(zhì)顆粒，對低溫敏感性差，比其他卵泡更能耐受冷凍過程，因此凍融后始基卵泡的存活率較高。但是，玻璃化冷凍組始基卵泡及初級卵泡的形態(tài)正常率相差不多，這可能是由于高濃度的冷凍保護劑及快速的降溫速度更適用于體積稍大的初級卵泡。對人卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的研究表明：無論程序冷凍還是玻璃化冷凍，經(jīng)培養(yǎng)后均可造成部分卵泡超微結(jié)構(gòu)的改變，這些細微的結(jié)構(gòu)改變是否對卵泡生物活性產(chǎn)生影響，還需要進一步研究。

冷凍復蘇后培養(yǎng)組織的激素活性測定是評價冷凍方案有效性的一個佐證。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮及冷凍卵巢組織中E2及P的含量隨著培養(yǎng)時間的延長而增高，提示卵巢組織在體外培養(yǎng)條件下生長發(fā)育良好；3組間差異無統(tǒng)計學意義。有研究[16]顯示，不僅僅是卵泡可以產(chǎn)生類固醇激素，取自絕經(jīng)期卵巢皮質(zhì)片中增生的基質(zhì)細胞(在體或離體)也能產(chǎn)生E2。因此，冷凍卵巢組織的內(nèi)分泌功能與生殖功能之間的關(guān)系值得進一步研究。卵巢組織的異體移植更加確切地說明了冷凍過程對卵巢功能的影響，經(jīng)過異體移植發(fā)現(xiàn)，程序冷凍法較玻璃化冷凍法具有更高的移植物回收率及卵泡密度。

通過組織學、激素釋放試驗及異體移植試驗能夠更好地檢測卵泡的存活狀態(tài)。本研究的結(jié)果表明，玻璃化冷凍法與程序冷凍法雖然在形態(tài)學檢測及激素釋放試驗方面的差異無統(tǒng)計學意義，但在異體移植試驗中程序冷凍法的效果優(yōu)于玻璃化冷凍法。因此，本研究得出結(jié)論是：由于程序冷凍法冷凍的人卵巢組織卵泡具有較高的發(fā)育潛能，因此較玻璃化冷凍法更有應用前景。

參考文獻

[1]Donnez J, Dolmans MM, Demylle D, et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue[J]. Lancet,2004,364(9443):1405-1410.

[2]Andersen CY,Rosendahl M,Byskov AG,et al．Two successful pregnancies following autotransplantation of frozen/thawed ovarian tissue[J].Hum Reprod,2008,23(10):2266-2272.

[3]Meirow D,Levron J,Eldar-Geva T,et al.Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy[J]. N Engl J Med,.2005,353(3):318-321.

[4]Schmidt KT,Rosendahl M,Ernst E,et al．Autotransplantation of cryopreserved ovarian tissue in 12 women with chemotherapy-induced premature ovarian failure: the Danish experience[J]．Fertil Steril，201l，95(2)：695-701.

[5]Rahimi G, Isachenko E, Isachenko V,et al. Comparison of necrosis in human ovarian tissue after conventional slow conventional freezing or rapid freezing and transplantation in ovariectomized SCID mice[J]. Reprod Biomed Online,2004,9(2):187-193.

[6]Gandolfi F,Paffoni A,Papasso Brambilla E,et al. Efficiency of equilibrium cooling and vitrification procedures for the cryopreservation of ovarian tissue:comparative analysis between human and animal models.Fertil Steril[J].2006,85(Suppl 1):1150-1156.

[7]Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results[J]. Hum Reprod, 1986,(2):81-87.

[8]Vajta G, Nagy ZP.Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory？ Review on vitrification[J]. Reprod Biomed Online,2006,12(6)：779-796

[9]Li YB1,Zhou CQ,Yang GF,et al.Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues[J].Chin Med J (Engl),2007,120(2):110-114.

[10]Isachenko V,Isachenko E,Reinsberg J,et al.Cryopreservation of human ovarian tissue:comparison of rapid and conventional freezing[J]. Cryobiology,2007,55(3):261-268.

[11]Isachenko E, Isachenko V, Nawroth F,et al. Human ovarian tissue preservation: is vitrification acceptable method for assisted reproduction? [J]. Cryo Letters,2008,29(4):301-314.

[12]Isachenko V, Lapidus I, Isachenko E, et al. Human ovarian tissue vitrification versus conventional freezing: morphological, endocrinological, and molecular biological evaluation[J]. Reproduction， 2009,138(2): 319-327.

[13]Keros V, Xella S, Hultenby K, et al. Vitrification versus controlled-rate freezing in cryopreservation of human ovarian tissue[J]. Hum Reprod, 2009, 24(7):1670-1683.

[14]Santos RR,Tharasanit T,Van Haeften T,et al. Vitrification of goat preantral follicles enclosed in ovarian tissue by using conventional and solid-surface vitrification methods[J]. Cell Tissue Res,2007,327(1):167-176.

[15]Huang L,Mo Y,Wang W,et al.Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2008,139(2):193-198.

[16]Wotiz HH，Davis JW，Lemon HM，et al.The conversion of testosterone to estrogens by human ovarian tissue[J]. J boil chem，1956, 222(1): 487-501.

Effects of Vitrification and Program Freezing on the Follicular Viability of Human Ovarian Tissues

LIULiyingQUWenyuJIANGLiZHANGXiaoliLIUXiaoliKONGGangCenterofReproductiveMedicine,Women′sandChildren′sHospitalofShenyanginLiaoningProvince,Shenyang110014,China

AbstractObjective：To compare the effect of vitrification and program freezing on the follicular viability of human ovarian tissues. Methods: Ovarian tissues from 15 patients were transported to the laboratory within 20 min after excision. Pieces of ovarian tissues (1 mm×5 mm×5 mm)were randomly divided into fresh group, vitrification group and program freezing group.Optimal experimental method was used in vitrification group and program freezing group. The fresh and resuscitated tissues were cultivated in vitro, and the follicular morphology was analyzed by using light and electron microscope.The viability of ovarian tissues resuscitated from freezing was detected by hormones releasing assay and allograft assay, and then compared with that of fresh group. Results: Morphologically normal and abnormal primordial and primary follicles could be seen in resuscitated freezing group and fresh group. The rate of morphologically normal follicles in fresh group was significantly higher than those in vitrification group and program freezing group(P<0.05).The rate of morphologically normal follicles was slightly higher in program freezing group than that in vitrification group(P>0.05). Primordial and primary follicles with normal and abnormal ultrastructure could be seen in all the three groups.Ovarian cortical pieces secreted estradiol and progesterone continuously after in vitro culture. Hormone levels in fresh group were higher than those in vitrification group and program freezing group(P>0.05). Allograft assay showed that there were more graft recovery number and higher follicular density in program freezing group than those in vitrification group. Conclusions: Follicle has higher potentiality of development in program freezing human ovarian tissues,so program freezing is more promising than vitrification in application.

Key WordsVitrification；Program freezing；Human ovarian tissues；Hormone releasing assay；Ultrastructure；Transplantation

通訊作者劉敏，E-mail：lm18950009388@sina.com

中圖分類號R71

文獻標識碼A