性別和年齡對(duì)慢性丙型肝炎患者外周血中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響

牛志立　張平安　童永清

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢　430060)

?

·論著·

性別和年齡對(duì)慢性丙型肝炎患者外周血中干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)的影響

牛志立張平安童永清

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430060)

摘要目的： 觀察不同性別、年齡的慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)和IFIT3的mRNA表達(dá)水平及意義。方法：選擇CHC患者215例以及健康人79名，取全血。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PBMC中IFIT1和IFIT3基因的mRNA表達(dá)；應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)；用熒光探針檢測(cè)HCV-RNA。結(jié)果：CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3的表達(dá)量與健康人群比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為22.35、22.75；P<0.05)。CHC患者的ALT、AST與健康人比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為34.38、21.38；P<0.05)。對(duì)CHC患者PBMC中的IFIT1、IFIT3基因表達(dá)量與年齡、性別、肝功能、LgHCV-RNA載量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，IFIT1、IFIT3基因的mRNA表達(dá)量與年齡(r分別為 0.395、0.482；P<0.05)和性別(r分別為0.453、0.358；P<0.05)呈正相關(guān)。結(jié)論：CHC患者PBMC中IFIT1、IFIT3基因的表達(dá)與性別和年齡相關(guān)。

關(guān)鍵詞慢性丙型肝炎;外周血單個(gè)核細(xì)胞;干擾素誘導(dǎo)基因

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)屬于黃病毒科，是單鏈正鏈RNA病毒。HCV宿主限于人類(lèi)和黑猩猩，可引起人類(lèi)丙型病毒性肝炎(丙型肝炎)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV的感染率約為3%[1]。最近有報(bào)告[2]認(rèn)為，女性比男性更易感染急性丙型肝炎，但是，男性丙型肝炎患者更易發(fā)展為肝纖維化、肝硬化和肝癌。有研究[3]表明，女性HCV感染者具有更強(qiáng)的病毒清除能力和持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virologic response，SVR)，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討不同性別和年齡的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中干擾素誘導(dǎo)基因(interferon stimulated gene，ISG) IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)和IFIT3的表達(dá)量及機(jī)體對(duì)HCV清除能力有否差異。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2013年3月—2014年8月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科就診的尚未接受治療的CHC患者215例，其中中老年患者100例，青年患者115例。中老年患者中，女性51例，男性49例；年齡48～72歲，平均(64±5)歲。青年患者中女性58例，男性57例；年齡24～43歲，平均(33±7)歲。215例患者的診斷符合《丙型肝炎防治指南》[4]；排除自身免疫系統(tǒng)疾病、其他系統(tǒng)性嚴(yán)重疾病及感染性疾病。對(duì)照組為同期來(lái)我院進(jìn)行體檢的79名健康人，其中女性37名，男性42名；年齡31～74歲，平均(46±8)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[編號(hào)：(2013)鄂倫字(KY-035)]，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑與儀器淋巴細(xì)胞分離液由天津美德太平洋科技有限公司提供，Trizol和SYBR Premix Ex Taq II由寶生物工程(大連)有限公司提供，反轉(zhuǎn)錄試劑盒由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司提供。PCR分析儀、VII7熒光定量分析儀由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)。

1.3研究方法

1.3.1引物設(shè)計(jì)引物由上海因維基生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列

1.3.2mRNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄采集所有研究對(duì)象的空腹靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝的采血管中，按照淋巴細(xì)胞分裂液說(shuō)明書(shū)(天津美德太平洋科技有限公司)提取單個(gè)核細(xì)胞。采用Trizol法提取總mRNA。取11 μL RNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入 1 μL oligo引物混勻并瞬時(shí)離心(65℃， 5 min)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配好反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：42℃ 60 min，72℃ 10 min，4℃保存。得到的cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3熒光定量PCR檢測(cè)取cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，根據(jù)說(shuō)明書(shū)配置反應(yīng)體系，總體積為20 μL。IFIT1、IFIT3、GAPDH的擴(kuò)增條件均為：94℃ 30 s預(yù)變性，94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 35 s，50個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)條件：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。計(jì)算2-ΔΔCt，比較CHC組和健康組3個(gè)基因(IFIT1、IFIT3、GAPDH)mRNA的表達(dá)量。對(duì)3個(gè)基因的cDNA進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)♂?個(gè)梯度，驗(yàn)證擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相差小于5%，且均為98%~102%，可以認(rèn)為兩者擴(kuò)增效率近似相等。

1.3.4HCV-RNA含量的測(cè)定據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明，采用熒光定量PCR檢測(cè)HCV-RNA并計(jì)算LgHCV-RNA載量(以10為底數(shù)的HCV-RNA含量的對(duì)數(shù))。HCV-RNA最低檢測(cè)限為1×103拷貝/mL。

1.3.5肝功能指標(biāo)檢測(cè)應(yīng)用德國(guó)Siemens ADVIA 2400型全自動(dòng)生化儀及配套試劑測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)。

2結(jié)果

2.1CHC患者和健康人群PBMC中IFIT1、IFIT3基因mRNA表達(dá)水平的比較以及肝功能指標(biāo)的比較CHC患者PBMC中的IFIT1、IFIT3mRNA表達(dá)量比健康人群低4.32倍、4.05倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為22.35、22.75，P<0.05)。CHC患者的ALT和AST與健康人群比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為34.38、21.38，P<0.05)，LgHCV-RNA載量均值為4.71拷貝/mL。見(jiàn)表2～3。

表2　CHC患者和健康人群PBMC中

注：ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]健康組-[Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)]CHC組

表3CHC患者和健康人群的肝功能指標(biāo)比較

(U/L)

注：LgHCV-RNA載量表示以10為底的HCV-RNA載量；-表示陰性；*表示不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.2CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3基因的mRNA表達(dá)水平與年齡、性別、肝功能、LgHCV-RNA載量的相關(guān)性分析CHC患者PBMC中，IFIT1和IFIT3基因的mRNA表達(dá)量與年齡(rIFIT1=0.395，rIFIT3=0.482；P<0.05)和性別(rIFIT1=0.453，rIFIT3=0.358，P<0.05)呈正相關(guān)，而與ALT、AST和LgHCV-RNA載量(rIFIT1分別為0.142、-0.138、-0.097；rIFIT3分別為0.148、-0.153、0.046；P<0.05)均無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表4～5。

表4　CHC患者PBMC中IFIT1基因的mRNA表達(dá)水平

注：LgHCV-RNA載量表示以10為底的HCV載量的對(duì)數(shù)

表5　CHC患者PBMC中IFIT3基因的mRNA表達(dá)水平

注：LgHCV-RNA載量表示以10為底的HCV載量的對(duì)數(shù)

2.3CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3基因的mRNA表達(dá)量水平與年齡、性別的Logistics線(xiàn)性回歸分析Logistics線(xiàn)性回歸分析結(jié)果顯示，CHC患者的年齡每增加1歲，IFIT1基因的mRNA閾值(Ct值)相應(yīng)地增加0.132個(gè)循環(huán)(t=4.736，P<0.05)，IFIT3基因的mRNA Ct值則相應(yīng)增加 0.190 個(gè)循環(huán)(t=5.629，P<0.05)。男性CHC患者IFIT1基因的mRNA Ct值比女性CHC患者高4.234個(gè)循環(huán)(t=5.344,P<0.05)，而前者IFIT3基因的mRNA Ct值比后者高4.144個(gè)循環(huán)(t=4.336,P<0.05)。IFIT1基因mRNA表達(dá)量與年齡、性別的回歸方程為：y=3.74+0.132×年齡+4.234×性別，且該方程對(duì)IFIT1基因mRNA表達(dá)量有38.7%的解釋程度。IFIT3基因mRNA表達(dá)量與年齡、性別的回歸方程為：y=1.936+0.190×年齡+4.144×性別，且該方程對(duì)IFIT3基因mRNA表達(dá)量有38.5%的解釋程度。見(jiàn)表6～7。

表6　CHC患者PBMC中IFIT1基因mRNA表達(dá)量

表7　CHC患者PBMC中IFIT3基因mRNA表達(dá)量

3討論

有研究[5-6]報(bào)道，不同性別人群對(duì)HCV的免疫反應(yīng)及抗病毒治療的效果不同。HCV感染的女性病毒自我清除能力強(qiáng)于HCV感染的男性。在HCV感染的女性群體中，年輕女性的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答比老年女性更高，但是青年男性和老年男性之間并無(wú)此差異。對(duì)HCV感染的老年人群的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)抗病毒治療的老年男性要比經(jīng)過(guò)抗病毒治療的老年女性更易獲得持久的病毒學(xué)應(yīng)答反應(yīng)，但是都不及絕經(jīng)前的女性[7]。

IFIT家族基因?qū)儆诟蓴_素誘導(dǎo)基因(interferon stimulated gene，ISG)，參與多種抗病毒免疫應(yīng)答。其中IFIT1和IFIT3通過(guò)與真核起始因子3 (eukaryotic initiation factor 3，eIF3)相互作用而參與非特異性抗病毒應(yīng)答，可抑制細(xì)胞和病毒中超過(guò)60%的蛋白質(zhì)合成[8]，尤其能夠限制HBV-DNA和HCV-RNA病毒的復(fù)制[9-10]。通過(guò)RNA干擾敲除IFIT1基因可使HCV病毒的復(fù)制增加[10]。病毒RNA攜帶的5′PPP-RNA被IFIT1識(shí)別后，可激活一系列的IFIT家族蛋白復(fù)合物，從而發(fā)揮抗病毒效應(yīng)[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CHC患者PBMC中IFIT1和IFIT3基因mRNA表達(dá)水平低于健康人群，這可能是HCV阻礙了ISG或細(xì)胞因子的表達(dá)而導(dǎo)致HCV慢性持續(xù)感染的原因[11]。有研究[12-14]表明，不同性別人群抗HCV感染能力的不同可能歸因于性激素水平的不同；雌激素具有增強(qiáng)免疫的作用，而雄激素具有抑制免疫的作用。另有研究[15]表明，隨著年齡的增加，激素水平下降，從而影響機(jī)體的免疫力。激素受體與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合可激活下游的核因子-kB(NF-kB)因子，而I型干擾素的激活需要NF-kB的參與[16]，這暗示雌激素對(duì)I型干擾素的表達(dá)具有促進(jìn)作用。I型干擾素(IFN-α，IFN-β)通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)通路而激活干擾素誘導(dǎo)基因(IFIT1和IFIT3)，從而發(fā)揮抗病毒作用[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)年齡、性別與Ⅰ型干擾素的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年齡和性別可影響IFIT1和IFIT3基因的mRNA表達(dá)水平；且隨著年齡的增加，IFIT1和IFIT3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，這可能是老年人易感染HCV并且易進(jìn)展為肝硬化、肝癌的一個(gè)原因。男性PBMC中IFIT1和IFIT3的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于女性，這有助于解釋不同性別人群抗HCV能力的差異。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CHC患者的肝功能指標(biāo)ALT、AST、HCV-RNA載量與IFIT1和IFIT3基因表達(dá)量無(wú)相關(guān)性，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Baden R, Rockstroh JK, Buti M. Natural history and management of hepatitis C: does sex play a role [J]? J Infect Dis, 2014,15,209 (Suppl 3):S81-85.

[2]石爽, 石青, 劉佳，等.丙型肝炎病毒復(fù)制與脂類(lèi)和脂蛋白代謝[J]. 中國(guó)病毒病雜志, 2011, 1( 4):317-320.

[3]Bernabucci V, Villa E. The role played by gender in viral hepatitis[J]. Scand J Clin Lab Invest Suppl, 2014, 244:90-94.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì).丙型肝炎防治指南[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(12): 775-780.

[5]Bakr I, Rekacewicz C, El Hosseiny M, et al. Higher clearance of hepatitis C virus infection in females compared with males[J]. Gut, 2006, 55(8):1183-1187.

[6]Floreani A, Cazzagon N, Boemo DG, et al. Female patients in fertile age with chronic hepatitis C, easy genotype, and persistently normal transaminases have a 100% chance to reach a sustained virological response[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2011, 23(11):997-1003.

[7]Villa E, Karampatou A, Cammà C, et al. Early menopause is associated with lack of response to antiviral therapy in women with chronic hepatitis C[J]. Gastroenterology, 2011, 140(3):818-829.

[8]Vladimer GI, Górna MW, Superti-Furga G. IFITs: Emerging Roles as Key Anti-Viral Proteins[J]. Front Immunol, 2014, 10(5):94.

[9]Pichlmair A, Lassnig C, Eberle CA, et al. IFIT1 is an antiviral protein that recognizes 5′-triphosphate RNA[J]. Nat Immunol, 2011, 12(7): 624-630.

[10]Raychoudhuri A, Shrivastava S, Steele R, et al. ISG56 and IFITM1 proteins inhibit hepatitis C virus replication[J]. J Virol,2011,85(24)：12881-12889.

[11]Jouan L, Chatel-Chaix L, Melancon P, et al. Targeted impairment of innate antiviral responses in the liver of chronic hepatitis C patients[J]. J Hepatol, 2012, 56(1):70-77.

[12]McClelland EE, Smith JM. Gender specific differences in the immune response to infection [J]. Arch Immunol Ther Exp (Warsz), 2011, 59(3):203-213.

[13]Howie SE. Go girls! Efficient female innate immunity[J]. Blood, 2011, 118(22):5718-5719.

[14]Furman D. Sexual dimorphism in immunity: improving our understanding of vaccine immune responses in men[J]. Expert Rev Vaccines, 2015,14(3):461-471.

[15]Kassi E, Moutsatsou P. Estrogen receptor signaling and its relationship to cytokines in systemic lupus erythematosus[J]. J Biomed Biotechnol, 2010, 2010(317):1-14.

[16]Ivashkiv LB, Donlin LT. Regulation of type I interferon responses[J]. Nat Rev Immunol, 2014, 14(1):36-49.

Effects of Gender and Age on the Expression of Interferon Stimulated Gene in the Peripheral Blood of Patients with Chronic Hepatitis C

NIUZhiliZHANGPing′anTONGYongqingDepartmentofLaboratoryScience,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China

AbstractObjective： To investigate the mRNA expression of interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 (IFIT1) and IFIT3 in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in patients with chronic hepatitis C(CHC) with different genders and ages. Methods： Anticoagulant whole blood was collected from 215 patients with CHC and 79 healthy individuals. The mRNA expression levels of IFIT1 and IFIT3 were detected by real-time quantitative PCR. Alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) were detected by automatic biochemical analyzer. HCV-RNA was detected with fluorescent probe. Results： Expression levels of IFIT1 and IFIT3 in PBMC of patients with CHC were significantly different from those in healthy people (t=22.35,P<0.05;t=22.75,P<0.05). There were statistically significant differences in ALT and AST between patients with CHC and healthy people (t=34.38,P<0.05;t=21.38,P<0.05). The correlation analysis of gene expression levels of IFIT1 and IFIT3 in PBMC with age， gender， liver function and HCV load in CHC patients revealed that the mRNA expression levels of IFIT1 and IFIT3 were positively correlated with age (r=0.395,P<0.05;r=0.482,P<0.05) and gender(r=0.453,P<0.05;r=0.358,P<0.05). Conclusions： The expressions of IFIT1 and IFIT3 in PBMC are correlated with gender and age in CHC patients.

Key WordsChronic hepatitis C;Peripheral blood mononuclear cells;Interferon stimulated gene

中圖分類(lèi)號(hào)R512.6+3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A