氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對SKOV3人卵巢癌細(xì)胞的作用

王東暉 劉丹彤 高潔凡 王曉紅 史春燕

氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對SKOV3人卵巢癌細(xì)胞的作用

王東暉 劉丹彤 高潔凡 王曉紅 史春燕

目的 探討氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法 MTT法檢測氧化苦參堿2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml三個(gè)劑量聯(lián)合順鉑3 μg/ml對細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對SKOV3細(xì)胞周期及凋亡率的影響;Western blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 。結(jié)果 與順鉑組相比，氧化苦參堿3個(gè)劑量均能不同程度抑制SKOV3細(xì)胞增殖，5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2個(gè)劑量與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，抑制率與氧化苦參堿濃度正相關(guān)。氧化苦參堿能增強(qiáng)順鉑對細(xì)胞周期的影響作用，與順鉑組比較G0/G1期細(xì)胞顯著增多(P＜0.05或P＜0.01);同時(shí)，氧化苦參堿聯(lián)合順鉑組較順鉑組細(xì)胞凋亡率有所升高，10.0 mg/ml劑量組與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。氧化苦參堿3個(gè)劑量均能不同程度下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2個(gè)劑量與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);氧化苦參堿3個(gè)劑量均能不同程度上調(diào)Bax蛋白表達(dá)調(diào)，10.0 mg/ml劑量組與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 氧化苦參堿具有增強(qiáng)順鉑對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用，并對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用，下調(diào)Bcl-4、上調(diào)Bax蛋白表達(dá)為其促凋亡機(jī)制之一。

卵巢癌;氧化苦參堿;順鉑;細(xì)胞凋亡

卵巢癌是嚴(yán)重威脅女性生命的惡性腫瘤，目前臨場常用治療手段主要是手術(shù)和化療，而鉑類是卵巢癌化療方案中最常用的藥物，但是腫瘤細(xì)胞對鉑類的耐藥性及其毒副作用往往導(dǎo)致化療方案難以順利實(shí)施。因此，尋找對化療藥物具有減毒或增效作用的輔助用藥非常必要。氧化苦參堿是從豆科植物苦參中提取分離的一種生物堿，它的抗腫瘤活性受到了廣泛關(guān)注并進(jìn)行了大量的機(jī)制研究［1，2］。本課題通過分析氧化苦參堿與順鉑聯(lián)合用藥的卵巢癌細(xì)胞的影響，為其臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細(xì)胞，購于吉妮歐生物科技公司。氧化苦參堿注射液購于正大天晴制藥公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品。Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購于上海碧云天生物技術(shù)研究所。Bcl-2、Bax一抗購于Abcam美國公司。Epics XL流式細(xì)胞儀，Beckman Coulter公司。SpectraMax M2酶標(biāo)分析儀，Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將卵巢癌SKOV3細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)無菌培養(yǎng)。細(xì)胞融合80%左右時(shí)，0.25%胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組:將SKOV3細(xì)胞分為空白對照組(A)、順鉑組(B)、順鉑與氧化苦參堿聯(lián)用三個(gè)劑量組(C、D、E)，順鉑終濃度為 3 μg/ml，氧化苦參堿三個(gè)濃度分別為 2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml，每組 10個(gè)復(fù)孔。

1.2.3 MTT法檢測氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞增殖的影響［3］:取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，每孔加細(xì)胞懸液 200 μl，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后，分別加入相應(yīng)藥物，空白對照組加入等量培養(yǎng)基。加藥48 h后，加入MTT 20 μl(濃度為2 g/L)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，時(shí)間為4 h，甩棄細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入200 μl DMSO(二甲基亞砜)，置震蕩器上震蕩1 min，使藍(lán)色晶體完全溶解后，用酶標(biāo)儀于570 nm處檢測吸光度(OD值)，并計(jì)算抑制率:抑制率=(空白對照組OD值-用藥OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞周期的影響［4］:取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，按5 ml/瓶移至無菌培養(yǎng)瓶中，每組6瓶，培養(yǎng)24 h后加藥，空白對照組加入等量培養(yǎng)基。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS清洗2遍，然后用70%乙醇溶液于4℃冰箱進(jìn)行固定，時(shí)長2 h，PI避光染色30 min后，300目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，以cxp Analysis軟件分析細(xì)胞周期及凋亡率。

1.2.5 Western blot法檢測氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響:細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，加藥作用48 h后，胰酶消化，收集細(xì)胞，將細(xì)胞裂解后收集蛋白，考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。將封閉后的硝酸纖維素膜置入TTBS稀釋(1∶500)的一抗溶液/β-actin(1∶1 000)稀釋液，4℃緩慢搖動(dòng)過夜。洗膜后，將膜置入適量以TTBS 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液中，于室溫反應(yīng)2 h。洗膜后抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測。將膠片掃描，Labworks軟件下對條帶進(jìn)行吸光度積分掃描，以β-actin作為內(nèi)參照，用目的蛋白灰度值/β-actin內(nèi)參照膠片灰度值的比值為蛋白的相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對SKOV3細(xì)胞增殖的影響MTT比色法顯示，氧化苦參堿與順鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制SKOV3細(xì)胞增殖，且能增強(qiáng)順鉑的抑制作用，其中氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2個(gè)劑量組與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或0.01)。見表1。

表1 氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對SKOV3細(xì)胞增殖的影響n=10，±s

表1 氧化苦參堿聯(lián)合順鉑對SKOV3細(xì)胞增殖的影響n=10，±s

注:與A組比較，*P ＜0.01;與B組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 OD值 抑制率(%)A組0.833±0.062 0 B組 0.657±0.041* 21.13 C組 0.621±0.053* 25.45 D組 0.608±0.044*# 27.01 E組 0.579±0.057＊△30.49

2.2 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞周期的影響與空白對照組比較，各用藥組G0/G1期細(xì)胞均增多(P＜0.01)，且氧化苦參堿3個(gè)劑量均能增強(qiáng)順鉑的作用(P＜0.05或P＜0.01);與空白對照組比較，S、G2/M期細(xì)胞均減少，其中G2/M期細(xì)胞減少尤為明顯(P ＜0.01)，氧化苦參堿 5.0 mg/ml、10.0 mg/ml組與順鉑組相比明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與空白對照組比較，各用藥組SKOV3細(xì)胞均顯著升高(P＜0.01)，而氧化苦參堿10.0 mg/ml組較順鉑組升高尤為明顯(P＜0.05)。見表2。

表2 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞周期的影響n=6，%，±s

表2 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞周期的影響n=6，%，±s

注:與A組比較，*P ＜0.01;與B組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率A組 47.28±5.73 39.72±4.65 13.01±1.96 3.21±0.54 B組 56.49±3.92* 36.03±4.02 7.48±1.21* 28.26±5.73*C組 63.72±6.05＊△ 30.97±4.11* 5.31±1.41*# 30.82±6.16*D組 65.14±5.22＊△ 29.72±3.69*# 5.14±1.33＊△ 34.73±5.92*E組 68.28±7.03*# 26.97±4.26＊△ 4.75±1.11＊△ 38.28±6.74*#

2.3 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，各用藥組Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P ＜0.05或P ＜0.01)，而Bax蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05或P＜0.01);與順鉑組比較，氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml組 Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)，氧化苦參堿10.0 mg/ml組Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)。見表3。

表3 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞Bcl-2、Bax相對蛋白表達(dá)量的影響n=3，±s

表3 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細(xì)胞Bcl-2、Bax相對蛋白表達(dá)量的影響n=3，±s

注:與A組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與B組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

組別Bcl-2 Bax A組0.67±0.03 0.36±0.04 B組 0.55±0.04* 0.48±0.05*C組 0.52±0.03# 0.53±0.05#D組 0.43±0.04#△ 0.58±0.06#E組 0.40±0.03#☆ 0.61±0.04#△

3 討論

MTT法常用于大規(guī)?？鼓[瘤藥物的篩選、腫瘤細(xì)胞放化療敏感性測定等，靈敏度高，經(jīng)濟(jì)。它的結(jié)果反映的是存活細(xì)胞的數(shù)量，但另一個(gè)方面，它又反映了藥物對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、死亡的綜合效應(yīng)。結(jié)果顯示，順鉑有效抑制了卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長，氧化苦參堿聯(lián)合用藥組對腫瘤細(xì)胞的抑制作用更為明顯，效果優(yōu)于單用順鉑組，且存在明顯的劑量依賴關(guān)系。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，是機(jī)體清除衰老、損傷、突變細(xì)胞的重要方式。目前，很多學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡受抑是腫瘤發(fā)生的重要原因，而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶標(biāo)。迄今為止，國內(nèi)外眾多科研人員借助分子生物學(xué)技術(shù)，就細(xì)胞凋亡做了大量的探索工作，提出了很多觀點(diǎn)和假說，但是仍然沒有找到有關(guān)細(xì)胞凋亡過程的確切機(jī)制［5，6］。有研究表明，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有相關(guān)性，細(xì)胞周期阻滯于哪一期，凋亡就發(fā)生在哪一期［7，8］。細(xì)胞周期分為間期和分裂期兩個(gè)階段，細(xì)胞大部分生命活動(dòng)時(shí)間是在間期度過的。間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細(xì)胞增殖周期能否順利進(jìn)行，主要取決于G1/S轉(zhuǎn)換盒G2/M轉(zhuǎn)換，這是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的2個(gè)節(jié)點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，順鉑能過將卵巢癌SKOV3細(xì)胞阻滯于G0/G1期，使得進(jìn)入S期的細(xì)胞比例有所降低。氧化苦參堿能夠增強(qiáng)順鉑對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的阻滯作用，并且隨濃度增高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，故我們推測，細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在G1期。凋亡的發(fā)生過程受到多種基因的調(diào)控，目前研究較多的有p53、caspase、Bcl-2等。Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡蛋白的代表，Bax是促細(xì)胞凋亡的代表，兩者相互拮抗，二者平衡時(shí)細(xì)胞正常生長［9］。隨著氧化苦參堿濃度的上升，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低，而Bax蛋白表達(dá)明顯升高，細(xì)胞凋亡率也隨之升高，故我們推測氧化苦參堿誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)失衡有關(guān)。

順鉑作為卵巢癌常用化療藥物，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性以及藥物本身的毒副反應(yīng)為臨床應(yīng)用造成了一定障礙，本研究對氧化苦參堿用于卵巢癌化療輔助用藥有一定的參考價(jià)值，但仍然存在缺陷，如只觀察了藥物對卵巢癌SKOV3一個(gè)時(shí)間點(diǎn)作用效果，未進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察來評價(jià)藥物作用與時(shí)間的關(guān)系，程度如何;順鉑只設(shè)一個(gè)劑量組，未進(jìn)行氧化苦參堿能否降低順鉑IC50值的相關(guān)研究等，這些我們將在后續(xù)研究中進(jìn)行完善。另外，氧化苦參堿對耐藥卵巢癌細(xì)胞株的作用、對其他卵巢癌細(xì)胞株的作用等一系列研究等待我們開展。我們將通過大量的研究工作來觀察氧化苦參堿能否在不影響療效的前提下降低化療藥物用量，增強(qiáng)化療效果，或增加腫瘤對化療藥物的敏感性。

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R 737.31

A

1002-7386(2015)23-3556-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．011

061001 河北省滄州市中心醫(yī)院(王東暉、劉丹彤、高潔凡、史春燕);河北省泊頭市婦幼保健醫(yī)院(王曉紅)

2015-06-10)