清熱類藥物高效液相色譜分析有效成分含量的方法研究

季曉紅

(江蘇省張家港市第三人民醫(yī)院，江蘇 張家港 215611)

中藥作為中華民族的瑰寶一直沿用了幾千年，在疾病的防治上發(fā)揮著重要的作用，中藥藥劑一直是中藥中最具價(jià)值的部分，具有其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)［1］。首先中藥制劑通過(guò)各種藥味的協(xié)同配合，形成具有獨(dú)特療效和低毒副作用的優(yōu)勢(shì)，其次中藥制劑具有持久性、穩(wěn)定性和高效性，其藥效使用率高，另外中藥制劑的儲(chǔ)存相對(duì)較為方便，給藥方式簡(jiǎn)單［2］。近年來(lái)我國(guó)的中藥制劑的研制取得了很大的進(jìn)展，特別是中藥復(fù)方的水平較之前有了很大的提高。事實(shí)上中藥制劑的制備是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，成分的提取需要用到不同的工藝，這種技術(shù)上的限制也造成了中藥制劑的藥物控制上不能做到面面俱到，質(zhì)量出現(xiàn)良莠不齊的表現(xiàn)［3］。為了讓中藥制劑的質(zhì)量得到保證，對(duì)其含量和有效成分進(jìn)行分析和把握，才能夠讓中藥制劑的制備更為的可控和精確，本文通過(guò)高效液相色譜法對(duì)清熱類藥物的有效成分進(jìn)行研究，總結(jié)提取的相關(guān)方法，供今后的中藥提取參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞與儀器

試劑:大黃素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)115239-202100);黃芩苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)0754-9872);鹽酸小檗堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)54633-30984)。清肺抑火片分別由三家公司提供:云南白藥集團(tuán)大理藥業(yè)有限公司，批號(hào)110419;云南省曲靖藥業(yè)有限公司，批號(hào)110423;修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)110644。磷酸二氫鉀(分析純，上海碩盟生物);乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)DIKMA公司);水為雙蒸水。

儀器:高效液相色譜儀(美國(guó)Queue systems);電子分析天平(日本奧林巴斯);超聲波清洗機(jī)(美國(guó)BD公司);高轉(zhuǎn)速冷凍離心機(jī)(德國(guó)BiofugeStratos)。

1.2 方法

色譜柱:Waters Atlantis dC18(250mm×4.5mm，5μm);流動(dòng)相:0.01mol/L的KH2PO4溶液(H3PO4調(diào)pH值為2.8)，乙腈(95∶5，V/V);洗脫程序采用梯度洗脫法:0～5min，26%A→26%A;5～10min，26%A→48%A;10～19min，48%A→60%A;流速1.0ml/min;波長(zhǎng)根據(jù)流動(dòng)相切換0～5min，316nm;6～10min，347nm;10～19min，254nm，溫度控制在28℃，進(jìn)樣量每次20μl。

1.3 對(duì)照品溶液的制備

鹽酸小檗堿、大黃素、黃芩苷取適量，通過(guò)甲醇稀釋制備到濃度為340、448、424μg/ml的單一對(duì)照品，分別取鹽酸小檗堿5.0ml、大黃素4.0ml、黃芩苷13.0ml，再加入色譜級(jí)的甲醇稀釋得到混合對(duì)照品進(jìn)行儲(chǔ)存。

1.4 供試品溶液的制備

對(duì)樣品進(jìn)行研磨，取0.3g至100ml的量瓶中，加入70%甲醇15ml，進(jìn)行超聲，約1h后靜置，離心過(guò)濾，取濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶當(dāng)中，稀釋后搖勻，得到供試品。

1.5 提取方法的選擇

樣品的提取率根據(jù)公式計(jì)算:Y=(C×V)×10-3/W，其中C為標(biāo)準(zhǔn)曲線求出來(lái)的樣品濃度，V為溶液的體積，W為樣品的重量。為了使被測(cè)的清熱藥物全部提取完整，本研究采用不同提取時(shí)間、溶液比列等方法進(jìn)行提取，摸索出最佳的甲醇濃度和超聲時(shí)間。

1.6 流動(dòng)相的選擇

主要考察了甲醇-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-三乙胺溶液、甲醇-三乙胺溶液的流動(dòng)相選擇，通過(guò)分離的效果選擇柱壓的大小，是否有拖尾的情況選擇合適的流動(dòng)相。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系的考察

取出對(duì)照品的混合儲(chǔ)存液，對(duì)三種對(duì)照品分別制備一系列濃度的溶液，其中鹽酸小檗堿分別為2.24、4.48、8.96、17.92、44.8、89.5μg/m l，大黃素分別為1.36、2.72、5.44、10.88、27.2、54.5μg/ml，黃芩苷分別為5.512、11.02、22.06、44.10、110.2、220.5μg/ml。吸取20μl注入色譜儀中，以峰面積Y對(duì)濃度X進(jìn)行線性觀察，回歸方程分別為鹽酸小檗堿:Y=41.93X-0.0392;大黃素:Y=19.96X-45.52;黃芩苷:Y=31.34X-46.98。結(jié)果，鹽酸小檗堿2.24～89.60μg/ml;大黃素:1.36～54.40μg/ml;黃芩苷5.51～220.50μg/ml范圍內(nèi)三者均與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

吸取混合儲(chǔ)存液20μl，進(jìn)行6次重復(fù)，對(duì)峰面積進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，三者的峰面積RSD分別為小檗堿1.4，大黃素1.7，黃芩苷0.87，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取儲(chǔ)存液20μl，分別在0、2、4、6、8、12h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)峰面積進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果顯示，三者的峰面積RSD分別為小檗堿0.74，大黃素1.8，黃芩苷2.1，溶液在12h之內(nèi)都處于穩(wěn)定狀態(tài)，見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

同一樣品，測(cè)定供試品，對(duì)其峰面積進(jìn)行檢測(cè)。三者的峰面積RSD分別為小檗堿0.69，大黃素1.8，黃芩苷1.2，說(shuō)明本方法檢測(cè)重復(fù)性好，見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

樣品分別為三個(gè)廠家的樣品，分別取3份按上述的方法制備成供試品，然后根據(jù)上述的對(duì)照品測(cè)試的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，對(duì)峰面積測(cè)定，計(jì)算出含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.6對(duì)照品混合溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖見(jiàn)圖1。

3 討論

中藥制劑的質(zhì)量監(jiān)控早在《太平惠民和劑局方》中就有相關(guān)的記載。隨著近年來(lái)我國(guó)中藥制劑的發(fā)展和國(guó)際化要求，中藥復(fù)方制劑的藥物控制也應(yīng)該得到更為深入的研究，質(zhì)量的控制顯得尤為關(guān)鍵，由于中藥制劑是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的提取過(guò)程，其質(zhì)量監(jiān)控難以全面化，因此質(zhì)量控制問(wèn)題一直是阻礙中藥制劑發(fā)展并影響其國(guó)際化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的重要原因。有效成分的控制成為中藥現(xiàn)代化的重要問(wèn)題，鑒于中藥分析技術(shù)的不斷發(fā)展，新的控制模式和檢測(cè)技術(shù)的推出，給中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了重要的思路。

現(xiàn)階段中藥制劑研究領(lǐng)域的質(zhì)量控制應(yīng)該遵循藥物質(zhì)量準(zhǔn)則，主要方法就是藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，利用現(xiàn)代的分離技術(shù)如超濾技術(shù)、超聲技術(shù)、膜分離技術(shù)等對(duì)藥物進(jìn)行提取分離，在藥效的基礎(chǔ)上對(duì)有效成分進(jìn)行藥理的分析，尋找出復(fù)方治療中有效成分，從而作為藥物含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 對(duì)照品混合溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖

清熱類藥物作為廣泛應(yīng)用于臨床的常用藥物，該類藥物不僅僅能夠抗病源微生物，還可以調(diào)節(jié)人體的免疫功能，具有廣泛的抗炎解熱的藥理活性，通過(guò)調(diào)節(jié)自身的免疫力提高人體的抗病能力。本文通過(guò)摸索實(shí)驗(yàn)條件，以清肺抑火片為例，探討清熱類藥物高效液相色譜分析有效成分的含量的方法學(xué)，選取了不同產(chǎn)家的清熱類藥物中清肺抑火片中黃芩、黃柏、大黃的活性成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素，通過(guò)高效液相色譜分析建立三種指標(biāo)成分含量的同步測(cè)定分析方法。結(jié)果顯示，高效液相色譜分析可以取得良好的分離效果，獲得較高的產(chǎn)品質(zhì)量，雖然不同廠家的藥物均達(dá)到合格藥品的標(biāo)準(zhǔn)，但是藥物之間還是存在一定的差異。

綜上所述，本研究拓展了高效液相色譜在藥物質(zhì)量的控制和監(jiān)督方面的實(shí)際應(yīng)用，證實(shí)了高效液相色譜分析對(duì)于清熱類藥物具有準(zhǔn)確性高、方法精密度好的特點(diǎn)，符合中藥藥物的檢測(cè)要求，通過(guò)不同廠家的藥物的對(duì)比分析，均為合格藥品，但是藥物存在一定的差異性，這可能與原材料的產(chǎn)地以及廠家的制備工藝有關(guān)，在差異在可控范圍之內(nèi)都將發(fā)揮一定的臨床療效，這也提示了仍有許多中藥的可控性問(wèn)題需要我們進(jìn)一步深入研究，從全方位多角度評(píng)價(jià)中藥制劑的優(yōu)劣。

［1］李文烈，曹海芳，魏剛，等.中藥制劑質(zhì)量控制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師，2012，9(7):32-35.

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［3］伍振峰，鄭琴，楊明，等.中藥制劑質(zhì)量控制的方法模式分析與研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37(9):1332-1336.