大蒜油對(duì)黑素瘤B16細(xì)胞增殖、凋亡及其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

葉克，許愛娥

（1．浙江省紹興市上虞區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，紹興312300；2．浙江省杭州市第三人民醫(yī)院，杭州310009）

研究證實(shí)，大蒜油（其生物活性物質(zhì)主要為大蒜辣素）能抑制細(xì)胞惡性增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞分化等作用，但具體機(jī)制仍不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的表達(dá)在惡性腫瘤的血管和淋巴管新生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，抑制VEGF及其受體的表達(dá)成為目前抑制腫瘤的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞增殖、凋亡及其VEGF 表達(dá)的影響，探討其抑制惡性黑素瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黑素瘤B16 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640 培養(yǎng)基為Gibco 公司產(chǎn)品；二甲基亞砜為Sigma 公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；原位凋亡檢測(cè)試劑盒為Roche 公司產(chǎn)品；C-myc、P16、VEGF、VEGFRs 鼠抗人單克隆抗體為Santa Cruz 公司產(chǎn)品；羊抗鼠IgG 二抗、SP 試劑盒購(gòu)于北京中杉公司；噻唑藍(lán)、TritonX-100、DAB 購(gòu)于Ameresco 公司；RNA-Solv Reagent 試劑盒購(gòu)于Bio-tek 公司；VEGF 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（基因庫(kù)序列號(hào)：NM_003376，上游：5′-GGAGGAGGGCAGAATCATCACGAA-3′，下游：5′-CACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3′）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備及實(shí)驗(yàn)分組 精選優(yōu)質(zhì)大蒜，參照《中國(guó)藥典》2005 版附錄XD 揮發(fā)油測(cè)定甲法，按優(yōu)選工藝提取[1]。獲揮發(fā)油，加生理鹽水調(diào)至每1 mL藥液相當(dāng)于含生藥1 g 的濃度。取大蒜油1 g，再用吐溫-80 2 g 和生理鹽水100 mL 制成10 g/L 大蒜油乳劑，4 ℃冰箱保存，臨用前再用培養(yǎng)基配置成10~200 mg/L 處理液。確定最佳濃度后，將實(shí)驗(yàn)分為2組，即對(duì)照組、大蒜油處理組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)黑素瘤B16 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.3 g/L L-谷氨酰胺及青、鏈霉素各1×105U/L 的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞增殖的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×107個(gè)/L，按每孔200 μL 接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 待細(xì)胞貼壁后，各孔依次加入10，25，50，75，100，200 mg/L 的大蒜油，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照（只加細(xì)胞）及空白對(duì)照（只加培養(yǎng)液），設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)點(diǎn)4 塊板（每24 h 取1塊）。分別培養(yǎng)24，48，72，96 h 后，加入MTT 20 μL/孔，置37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 150 μL 充分振蕩，使紫色沉淀充分溶解，在30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm 處的光吸收值（A490），并計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度的大蒜油對(duì)B16 細(xì)胞的抑制率。抑制率=[（對(duì)照組A490－實(shí)驗(yàn)組A490）/對(duì)照組A490]×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8×107個(gè)/L，以90 μL/片接種于12 孔板中的蓋玻片上培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入100 mg/L大蒜油處理液，并設(shè)對(duì)照組（不含大蒜油）。48 h 后，取出蓋玻片嚴(yán)格按照原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。細(xì)胞核呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞（即凋亡細(xì)胞）。于光鏡下計(jì)數(shù)5 個(gè)高倍視野中>1 000 個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和凋亡的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果以凋亡指數(shù)（Apoptosis index，AI）表示。AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 免疫組化檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度接種于蓋玻片。次日對(duì)照組和大蒜油處理組分別加入含2%胎牛血清培養(yǎng)液及100 mg/L 大蒜油處理液。48 h 后終止培養(yǎng)，PBS 沖洗3 遍，5 min/次，晾干，冰丙酮固定，3%H2O2室溫下孵育，10%山羊血清封閉，滴加鼠抗人P16、C-myc 一抗（空白對(duì)照以PBS 代替）4 ℃過(guò)夜，PBS 洗滌，加二抗，DAB 顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。P16 的表達(dá)以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，C-myc 的表達(dá)以細(xì)胞核有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，細(xì)胞未著色或僅輕微著色者為陰性。陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用HPIAS2000 型軟件隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 RT-PCR 檢測(cè) 按對(duì)照組和大蒜油處理組分別加入培養(yǎng)液及100 mg/L 大蒜油處理液。48 h 后終止培養(yǎng)。 TRIzol 法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR 反應(yīng)檢測(cè)VEGF mRNA 的表達(dá)。PCR 反應(yīng)體系25 μL，包括10 pmol 各對(duì)上下游引物、200 mmol/L dNTP、2.5 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl、2 U Taq 酶、1 μL cDNA、DEPC 水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：96 ℃3 min，1 循環(huán)；96 ℃1 min 10 s，57 ℃1 min 10 s，72 ℃1 min 20 s，35 循環(huán)；72 ℃7 min。陰性對(duì)照為無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄樣本，以排外可能來(lái)源于污染的基因組DNA 的擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物在含有適量溴化乙錠的1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2.7 Western Blot 檢測(cè) 100 mg/L 大蒜油作用細(xì)胞48 h 后，WB 法檢測(cè)VEGF 蛋白的表達(dá)。細(xì)胞裂解法提取總蛋白，定量后加上樣緩沖液，行SDSPAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)（孵一抗二抗），ECL 反應(yīng)及曝光、顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0 軟件分析。抑制率及細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）之間的比較，均采用方差分析及兩兩比較的q 檢驗(yàn)。P16、C-myc 陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用t 檢驗(yàn)，P<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞增殖的影響 MTT法結(jié)果顯示，10 mg/L 和25 mg/L 的大蒜油對(duì)B16 細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用，200 mg/L 的大蒜油對(duì)B16 細(xì)胞的作用接近100 mg/L 大蒜油的抑制作用。當(dāng)大蒜油在50~100 mg/L 范圍時(shí)，表現(xiàn)出以下特點(diǎn)：①?gòu)?4 h開始，不同濃度的大蒜油對(duì)B16 細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，到96 h 達(dá)到最大抑制率，與對(duì)照組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），見表1；②當(dāng)大蒜油濃度從50、75 mg/L 一直到100 mg/L 時(shí)，抑制率逐漸增高。③以細(xì)胞的存活率與劑量的對(duì)數(shù)作圖，并按作圖法求出藥物的半數(shù)抑制濃度值IC50為26.94~45.27 mg/L。

表1 大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

表1 大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞增殖的抑制作用（±s）

注：*表示P＜0.01 vs.對(duì)照組。

G.O 濃度（mg/L）24 h 48 h 72 h 96 h抑制率 抑制率 抑制率 抑制率對(duì)照組 0 0 0 0 10 11.41 12.17 8.82 11.35 25 26.55* 13.26 23.63* 22.71*50 37.93* 47.45* 55.93* 67.82*75 62.11* 65.65* 79.75* 83.52*100 74.51* 74.29* 86.39* 91.52*200 73.44* 77.18* 90.36* 92.37*

2.2 大蒜油誘導(dǎo)黑素瘤B16 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 結(jié)果表明，以0、50、100 mg/L 的大蒜油誘導(dǎo)后，黑素瘤B16 細(xì)胞的AI 分別為0.37±0.12、8.86±2.16、23.49±3.28，與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。

2.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 100 mg/L 的大蒜油誘導(dǎo)黑素瘤B16 細(xì)胞48 h，P16、C-myc 蛋白的表達(dá)率分別為（0．318±0．021）%、（0．216±0．021）%，對(duì)照組P16、C－myc 的表達(dá)率為（0．229±0．015）%、（0．456±0．018）%，2 組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。

2.4 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果 黑素瘤B16 細(xì)胞VEGF的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank 中相應(yīng)序列完全一致。100 mg/L 的大蒜油誘導(dǎo)黑素瘤B16 細(xì)胞48 h，其VEGF mRNA 表達(dá)較對(duì)照組顯著下降，見圖1，半定量分析后，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖1 VEGF mRNA 表達(dá)電泳圖

2.5 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果 VEGF 為分子質(zhì)量為24 ku 的條帶。100 mg/L 的大蒜油誘導(dǎo)黑素瘤B16細(xì)胞48 h，其VEGF 蛋白質(zhì)的表達(dá)亦較對(duì)照組顯著下降，見圖2，半定量分析后，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

3 討論

圖2 VEGF 的蛋白質(zhì)表達(dá)印跡圖

因大蒜油來(lái)源充足且毒性小，近年來(lái)對(duì)其研究日益增多。大蒜油的有效成分為大蒜辣素[1]，大量的藥理實(shí)驗(yàn)證明，具有抗菌、抗病毒作用，并對(duì)多種腫瘤細(xì)胞亦有直接殺傷和抑制增殖的作用[2-3]，其抗腫瘤效應(yīng)可能存在多種作用機(jī)制。陳思遠(yuǎn)等[4]闡明，大蒜素抑制和殺傷黑素瘤細(xì)胞的作用可能與下調(diào)Ras基因的表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步闡明大蒜油在防治腫瘤過(guò)程中的作用及機(jī)制，我們研究了大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞增殖、凋亡及其VEGF 表達(dá)的影響，探討大蒜油抑制惡性黑素瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，為其臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

本研究中，我們觀察了不同濃度的大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞作用不同時(shí)間增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，終濃度為50~100 mg/L 的大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性，最高抑制率達(dá)92.54%。TUNEL 法結(jié)果顯示，以100 mg/L的大蒜油誘導(dǎo)細(xì)胞48 h 后，AI 與對(duì)照組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p16 基因是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，其失活可導(dǎo)致P16 蛋白表達(dá)缺失，引起細(xì)胞增殖失控而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。C-myc 基因是與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)的原癌基因，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的雙重作用。免疫組化結(jié)果顯示，100 mg/L 的大蒜油可引起人黑素瘤B16 細(xì)胞P16 表達(dá)的上調(diào)，而C-myc 蛋白表達(dá)下降。以上結(jié)果表明，大蒜油對(duì)黑素瘤B16 細(xì)胞具有顯著的抑制其增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用，其誘導(dǎo)黑素瘤B16 細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與上調(diào)P16 而下調(diào)C-myc 蛋白的表達(dá)有關(guān)。

對(duì)實(shí)體腫瘤的研究證實(shí)，瘤體需要有新生血管供氧及營(yíng)養(yǎng)支持才能繼續(xù)生長(zhǎng)。通常在腫瘤的早期或中期，腫瘤獲得了促進(jìn)血管生成的能力，此過(guò)程稱為“血管生成開關(guān)”[5]。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞能分泌多種促進(jìn)血管生成的因子，打破體內(nèi)促血管生成因子和抑制血管生成因子間的平衡，其中起主要作用并且研究較多的是VEGF。VEGF 家族被認(rèn)為是一組與腫瘤血管和淋巴管生成關(guān)系最為密切的生長(zhǎng)因子，特異性地作用于內(nèi)皮細(xì)胞，由VEGF-A、B、C、D、E 及胎盤生長(zhǎng)因子（PIGF）等6 個(gè)成員組成。VEGF 通過(guò)與受體及輔助受體特異性結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。在許多實(shí)體腫瘤，都觀察到VEGF 及其受體表達(dá)增加，并與常規(guī)化療效果和預(yù)后不良有關(guān)。惡性黑色素瘤組織中VEGF 的高表達(dá)是更為準(zhǔn)確的預(yù)后不良因素[6]。許多研究發(fā)現(xiàn)惡性黑素瘤VEGF-A 的表達(dá)率增高，并與瘤組織血管密度增高、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨髓微轉(zhuǎn)移及其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移高有關(guān)[6-8]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR 和Western Blot 檢測(cè)了黑素瘤B16 細(xì)胞中VEGF mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)：在黑素瘤B16 細(xì)胞中有VEGF mRNA 和蛋白質(zhì)的高表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)黑素瘤B16 細(xì)胞經(jīng)100 mg/L 大蒜油處理48 h 后VEGF 的mRNA 和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著下降，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），即大蒜油對(duì)兩者的表達(dá)具有顯著的抑制作用。綜上所述，在黑素瘤B16 細(xì)胞中可見VEGF mRNA 及蛋白質(zhì)的高表達(dá)，從而為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移提供條件。而100 mg/L 大蒜油作用48 h后，兩者的表達(dá)顯著下降，可見大蒜油通過(guò)下調(diào)兩者的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

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