細(xì)粒棘球蚴14-3-3重組抗原誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的研究

李宗吉，趙 巍

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué) 臨床檢驗與血液檢驗教研室，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué) 科技中心，寧夏 銀川 750004)

包蟲病是由棘球絳蟲的幼蟲感染并寄生于人畜體內(nèi)引發(fā)的一種呈世界性分布的人畜共患寄生蟲病，該病嚴(yán)重危害人類的健康和農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，是全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。我國是包蟲病發(fā)病率最高的國家之一，該病被列為我國重點防治的寄生蟲病[2]。目前研制包蟲病新型疫苗，進(jìn)行免疫預(yù)防是預(yù)防和控制包蟲病傳播的最為理想的方法[3]。

本實驗室前期已經(jīng)構(gòu)建并表達(dá)了細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴(Echinococcus granulosus，Eg)14-3-3 重組蛋白(rEg14-3-3)，初步免疫學(xué)研究表明該重組蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，并可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的免疫保護力，其中體液免疫應(yīng)答在免疫保護中起重要作用[4]。此外，濾泡輔助性T 細(xì)胞(Tfh)在體液免疫應(yīng)答中也具有重要作用。其主要功能是促進(jìn)B 細(xì)胞的活化、增殖和分化，生成抗原特異性漿細(xì)胞及維持長效免疫應(yīng)答的記憶B 細(xì)胞，并參與抗體類別的轉(zhuǎn)化。而Tfh 在寄生蟲感染的體液免疫應(yīng)答中的作用鮮有報道[5-7]。本實驗通過免疫前后及原頭蚴攻擊感染前后小鼠血清中特異性IgG、IgE 及其抗體亞型的動態(tài)觀察，并檢測Tfh 細(xì)胞的主要效應(yīng)分子IL-21 的表達(dá)情況，為研究重組疫苗免疫機理和Tfh 細(xì)胞在細(xì)粒棘球蚴感染及重組疫苗誘導(dǎo)的抗感染免疫應(yīng)答中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 rEg14-3-3 由本實驗室經(jīng)原核表達(dá)并純化；Eg 為從寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科包蟲病患者手術(shù)摘除的完整包囊中無菌條件下抽取囊液，分離原頭蚴，采用5 g/L 伊紅染色計數(shù)原頭蚴的著色率及形態(tài)，原頭蚴的存活率>95 %，經(jīng)PBS 稀釋為1.5×107個/L 懸液，用于攻擊感染ICR小鼠。40 只6 周齡～8 周齡雄性ICR 小鼠(體質(zhì)量為18 g±2 g)購自寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG3、IgG2a、IgG2b及IgE 均購自華美生物工程公司北京分公司；IL-21檢測試劑盒購自上海自信裕生物科技有限公司。

1.2 實驗設(shè)計 將ICR 小鼠隨機分為rEg14-3-3 免疫組和佐劑對照組，每組20 只。于0、2 周、4 周背部皮下多點注射各免疫1 次，共3 次，免疫組首免注射rEg14-3-3 10 μg/只和等量弗氏完全佐劑，以后2 次為加強免疫均采用10 μg/只的rEg14-3-3和等量弗氏不完全佐劑。佐劑對照組免疫方案相同，只注射弗氏佐劑和PBS，注射量為100 μL/只。于0、1 周、2 周、4 周、6 周、9 周、10 周、18 周、30 周和36 周尾部采血，分離血清，-85 ℃保存。

1.3 攻擊感染 將收集得到的活的原頭蚴立即注射到實驗組和對照組末次免疫4 周后小鼠的腹腔，每組每只小鼠腹腔注射2 000 只活的原頭蚴。

1.4 血清收集 在小鼠免疫rEg14-3-3 后的0、2周、4 周、6 周以及攻擊感染后2 周(初次免疫后10周)、10 周(初次免疫后18 周)、16 周(初次免疫后24 周)及36 周分別從尾部靜脈采血，每次每組5只，室溫靜置6 h，3 000 r/min 離心10 min，收集8個時間點的血清，-85 ℃凍存待測。

1.5 IL-21、IgG及其亞型和IgE抗體水平的檢測按照試劑盒說明對IL-21 進(jìn)行檢測。采用終濃度為10 mg/L rEg14-3-3 PBS 緩沖液(pH9.6)包被96 孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，4 ℃過夜；50 g/L 脫脂奶粉37 ℃封閉2 h；加1∶100 稀釋的蛋白免疫組或?qū)φ战M小鼠血清，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)2 h；分別加入1∶1 000稀釋的山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 或IgE-HRP，100 μL/孔，37 ℃反應(yīng)2 h；TMB底物顯色后測定每孔OD490nm值。檢測免疫及攻擊感染前后8 個時間點小鼠血清中IgG、IgG1、IgG3、IgG2a、IgG2b 和IgE 水平的動態(tài)變化。

1.6 免疫保護力的計算 原頭蚴攻擊感染24 周后迫殺兩組小鼠，檢查并計數(shù)肝臟及腸系膜處的棘球蚴包囊，計算免疫保護力：免疫保護力(%)=(1-免疫組平均包囊數(shù)/對照組平均包囊數(shù))×100 %

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0 軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1 IgG 抗體檢測結(jié)果 對rEg14-3-3 免疫前后和攻擊感染后實驗組小鼠及對照組小鼠血清抗體IgG進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，實驗組小鼠在rEg14-3-3 免疫后IgG 抗體水平隨著時間和免疫次數(shù)的增加迅速升高，在首免2 周后rEg14-3-3 免疫組小鼠IgG 抗體與對照組即有顯著性差異(p<0.05)；原頭蚴攻擊感染后2 周(初次免疫后10 周)兩組抗體水平均顯著升高，實驗組抗體水平在10 周達(dá)到峰值，對照組小鼠抗體水平在18 周達(dá)到峰值，此后兩組小鼠抗體在較長時間內(nèi)維持較高水平(圖1)。

圖1 小鼠免疫和感染后IgG 水平動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of IgG in sera of ICR mice vaccination and challenge

2.2 IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3動態(tài)變化 對rEg14-3-3 免疫前后和攻擊感染后實驗組小鼠及對照組小鼠血清IgG 抗體亞型進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，實驗組小鼠在rEg14-3-3 免疫后IgG 各亞型抗體水平隨著時間和免疫次數(shù)的增加迅速升高，其中IgG1、IgG2b、IgG3 在18 周抗體水平達(dá)到峰值，IgG2a 抗體水平在第10 周達(dá)到峰值，此后兩組小鼠抗體在較長時間內(nèi)維持在較高水平。在原頭蚴攻擊感染后IgG 各亞型抗體水平迅速升高，其中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 分別在30 周、10 周、18 周、18 周抗體水平達(dá)到峰值，隨后抗體水平逐步降低。在首免后的2 周、4 周、6 周實驗組小鼠IgG 各亞型抗體與對照組均具有顯著性差異(p<0.05)，在原頭蚴攻擊感染后對照組小鼠抗體水平迅速增高，實驗組與對照組小鼠各亞型抗體水平組間差異逐漸減小，除IgG1 外IgG2a、IgG2b、IgG3 在第36 周抗體水平無顯著性差異。此外，對照組小鼠IgG1 與IgG2a 的比值在0、2 周、4 周、6 周、10 周、18 周、30 周、36 周分別為1.41、1.71、1.36、1.41、1.09、1.90、1.71、1.07 均大于1，rEg14-3-3 免疫組IgG1 與IgG2a 的比值分別為1.21、0.94、0.62、0.63、0.72、1.46、1.69、1.16，在免疫18 周內(nèi)IgG1/IgG2a<1，18 周之后IgG1/IgG2a>1(圖2)。

圖2 rEg14-3-3 免疫前后和攻擊感染后小鼠血清IgG 抗體亞型檢測Fig.2 Dynamic changes of IgG subclass in sera of mice post vaccination and challenge

2.3 IgE抗體檢測結(jié)果 對rEg14-3-3 免疫前后和攻擊感染后實驗組小鼠及對照組小鼠血清抗體IgE進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，實驗組小鼠在rEg14-3-3 免疫后IgE 抗體水平在免疫后比免疫前水平有所升高，但實驗組與對照組小鼠在攻擊感染前無顯著性差異，實驗組小鼠在18 周抗體水平達(dá)到峰值，此時實驗組與對照組小鼠抗體水平具有顯著性差異(p<0.05），此后抗體水平有所降低。對照組小鼠在原頭蚴攻擊感染后IgE 抗體水平升高，在18 周達(dá)到峰值，此后兩組小鼠抗體在較長時間內(nèi)維持在較高水平(圖3)。

2.4 IL-21檢測結(jié)果 對rEg14-3-3 免疫前后和攻擊感染后實驗組小鼠及對照組小鼠血清IL-21 水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：rEg14-3-3 免疫1 周后實驗組小鼠IL-21 水平即迅速升高，在第9 周(原頭蚴攻擊感染后1 周)達(dá)到峰值，對照組小鼠IL-21 水平在第9 周迅速升高，第18 周達(dá)到峰值，實驗組和對照組IL-21 水平在1 周、9 周、18 周有顯著性差異(p<0.05)，此后兩組IL-21 細(xì)胞因子水平逐漸降低，相對免疫前小鼠在較長時間內(nèi)維持在相對較高水平(圖4)。

圖3 rEg14-3-3 免疫前后和攻擊感染后小鼠血清抗體IgE 檢測Fig.3 Dynamic change of IgE in sera of mice post vaccination and challenge

圖4 IL-21 水平的ELISA 檢測Fig.4 The detection of cytokine IL-21 level by ELISA

2.5 小鼠抗包蟲感染保護力的測定結(jié)果 原頭蚴攻擊感染24 周后迫殺兩組小鼠，檢查并計數(shù)肝臟及腸系膜處的棘球蚴包囊，rEg14-3-3 蛋白免疫組和佐劑對照組的棘球蚴包囊平均直徑分別為2.2±0.15 mm和8.5±0.63 mm，包囊數(shù)目分別為0.60±0.787 個和3.86±3.141 個，同時rEg14-3-3 免疫ICR 小鼠可獲得84.47 %的免疫保護力(表1)。

表1 rEg14-3-3 蛋白免疫組和對照組包囊數(shù)目和保護力Table1 Numbers of hydatid cysts and protective immunity induced by vaccinated and control mice

3 討論

在本實驗室前期表達(dá)、純化rEg14-3-3 的基礎(chǔ)上，本研究對其進(jìn)行進(jìn)一步免疫學(xué)特性研究[8]。14-3-3 蛋白是近年來寄生蟲疫苗和藥物靶蛋白研究的熱點，在血吸蟲屬和棘球蟲屬中均對其進(jìn)行了研究[9-12]。血吸蟲14-3-3 疫苗免疫小鼠后尾蚴攻擊感染得到達(dá)45 %的免疫保護力[13]，Sm14-3-3-1 重組蛋白也誘導(dǎo)出達(dá)到46 %的免疫保護力[14]。對于棘球蟲屬而言，多囊棘球蚴14-3-3 免疫小鼠后，蟲卵攻擊感染，可產(chǎn)生達(dá)78.5 %～82.9 %減囊率[15]，本實驗室前期研究表明細(xì)粒棘球蚴14-3-3 在小鼠中可誘導(dǎo)84%以上的免疫保護力。對疫苗誘導(dǎo)免疫保護機理的深入研究，是該疫苗能夠最終應(yīng)用的理論基礎(chǔ)。

研究表明體液免疫反應(yīng)在抗包蟲感染中起關(guān)鍵性作用。在體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生的抗體中，人體血清免疫球蛋白IgG 是初級免疫應(yīng)答中最持久、最重要的抗體，它在抗感染中起到主力軍作用。IgE 在寄生蟲感染中可與嗜酸性粒細(xì)胞協(xié)同，對寄生蟲的感染具有防御作用，IgE 抗體的產(chǎn)生是在寄生蟲感染的情況下能夠看到的具有特征性的免疫反應(yīng)。并且，體液免疫的保護效力不僅與IgG、IgE 水平相關(guān)而且和IgG 抗體亞型相關(guān)[12-13]。IgG 及其亞型的動態(tài)變化反應(yīng)了重組疫苗在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)Th1/Th2 混合型免疫反應(yīng)，感染早期以Th1 型免疫應(yīng)答和IGg2a 和IGg2b 抗體反應(yīng)占優(yōu)勢的抗感染免疫，感染慢性期逐步趨向于Th2 型免疫應(yīng)答和IGg1 和IG3抗體占優(yōu)勢的免疫反應(yīng)，該疫苗分子誘導(dǎo)的免疫方式有利于在寄生蟲感染早期啟動強效的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答殺滅寄生蟲，而在感染慢性期趨向Th2 型體液免疫為主的免疫應(yīng)答發(fā)揮長效免疫保護效應(yīng)，該疫苗分子誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答方式為后續(xù)疫苗的構(gòu)建、優(yōu)化、應(yīng)用提供了可借鑒的經(jīng)驗和依據(jù)。rEg14-3-3 疫苗免疫及原頭蚴攻擊感染后實驗組和對照組小鼠IgE 抗體水平雖有上升但組間無顯著性差異，表明重組疫苗主要誘導(dǎo)以IgG 為主的體液免疫反應(yīng)，IgG 及其亞型在重組疫苗的抗感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮主要的免疫保護作用。目前已有大量研究證明Tfh 細(xì)胞在誘導(dǎo)抗原特異性B 細(xì)胞活化、增殖、分化為分泌高親和力抗體的漿細(xì)胞及維持長效免疫的記憶性B 細(xì)胞及抗體類型轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。本研究檢測了Tfh 細(xì)胞的主要效應(yīng)分子IL-21 在疫苗免疫組及對照組不同免疫及感染階段的表達(dá)水平，觀察到IL-21 細(xì)胞因子在疫苗免疫后及細(xì)粒棘球蚴蟲感染后表達(dá)迅速升高，初步表明分泌IL-21 的Tfh細(xì)胞參與細(xì)粒棘球蚴感染及重組疫苗誘導(dǎo)的抗感染體液免疫應(yīng)答及抗體類型轉(zhuǎn)換，詳細(xì)作用機制還需后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

由于寄生蟲結(jié)構(gòu)復(fù)雜、抗包蟲的免疫保護機制也較為復(fù)雜，并且重組疫苗所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的類型與強度與免疫佐劑密切相關(guān)，本研究室后續(xù)將會進(jìn)一步對重組疫苗誘導(dǎo)的免疫機理尤其是Tfh 在體液免疫中的免疫作用及機理進(jìn)行深入研究，并且不斷優(yōu)化免疫方案及選擇更為安全有效的佐劑來提高疫苗的免疫效果及安全性，為抗包蟲疫苗的最終應(yīng)用提供理論和實驗資料。

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