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    海參精囊兩種提取物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷的保護(hù)作用

    2015-03-09 08:36:32郭錫春劉占濤劉春寶吳巖強(qiáng)濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科山東濰坊6101青島大學(xué)藥學(xué)院山東青島6601青島大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院山東青島6601大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司遼寧大連116100
    中國藥房 2015年4期
    關(guān)鍵詞:精囊附睪海參

    郭錫春,高 華,劉 坤,劉占濤,張 婕,高 文,劉春寶,吳巖強(qiáng)(1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科,山東濰坊 6101;.青島大學(xué)藥學(xué)院,山東青島 6601;.青島大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,山東青島 6601;.大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司,遼寧大連 116100)

    近年來,有關(guān)自由基在各種疾病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。研究表明,自由基損傷機(jī)制與環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CP)引起的生精功能障礙有密切關(guān)系[1]。含氧自由基及其產(chǎn)物會(huì)利用機(jī)體的脂質(zhì)過氧化作用影響細(xì)胞的正常生理功能,甚至引起細(xì)胞死亡[2]。

    海參作為人們熟知的海中珍品,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,其含有的多種活性成分已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、提高免疫力及延緩衰老的藥理作用[3-4]。海參精囊為海參的生殖器官,也具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此本實(shí)驗(yàn)通過建立衰老的動(dòng)物模型,利用不同劑量的海參精囊提取物飼養(yǎng)小鼠,檢測(cè)提取物對(duì)小鼠睪丸的總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性和丙二醛(MDA)水平的影響,同時(shí)觀察睪丸和附睪的臟器指數(shù)變化,以探討海參精囊提取物對(duì)CP誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷的保護(hù)作用。

    1 材料

    1.1 儀器

    AR5120 型電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司);DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司);SK3200H 型超聲波清洗機(jī)(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);LD4-2A型低速離心機(jī)(北京雷勃爾離心機(jī)有限公司,離心半徑:5 cm);723N 型可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

    1.2 藥材

    海參精囊由大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司提供,所用海參為刺參(Stichopus japonicus),由中國科學(xué)院海洋研究所段德麟研究員鑒定。

    1.3 藥品與試劑

    0.9%氯化鈉(NaCl)溶液(辰欣藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):1207215121);甲睪酮片(上海信誼康捷藥業(yè)有限公司,批號(hào):110802,規(guī)格:5 mg/片);注射用CP(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào):12031425,規(guī)格:0.2 g/瓶);總蛋白定量測(cè)試盒、TSOD 測(cè)試盒、GSH-PX 測(cè)試盒、MDA 測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20130604、20130603、20130525、20130605)。

    1.4 動(dòng)物

    2 方法

    2.1 提取物的制備

    2.1.1 海參精囊水提物 稱取一定量海參精囊,用組織勻漿器打碎,按質(zhì)量比1∶3加入蒸餾水,采用超聲波輔助提取,超聲溫度30 ℃,超聲時(shí)間25 min,然后水浴30 ℃條件下攪拌提取2 h,并以4 000 r/min 離心5 min,取上清液;沉淀物按質(zhì)量比1 ∶2加入蒸餾水,重復(fù)上述操作,合并上清液,通過快速定性濾紙濾過,濾液旋蒸濃縮至1/3時(shí),進(jìn)行冷凍干燥得到粗提物。

    2.1.2 海參精囊醇提物 將預(yù)凍好的海參精囊進(jìn)行冷凍干燥,然后稱取一定量,粉碎,按質(zhì)量比1 ∶10 加入無水乙醇,30 ℃條件下攪拌提取3 h,濾過后取濾液;殘?jiān)促|(zhì)量比1∶5加入無水乙醇,重復(fù)上述操作,合并濾液,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮并回收乙醇,濃縮液進(jìn)行真空干燥得到浸膏。

    2.2 動(dòng)物模型制備及分組、給藥

    108 只小鼠隨機(jī)分成9 組,每組12 只,空白組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液,其他各組均腹腔注射CP(28 mg/kg),連續(xù)5 d 以復(fù)制動(dòng)物雄激素部分缺乏、生殖系統(tǒng)受損模型;同時(shí)灌胃給予相應(yīng)的藥物:海參精囊水提物和醇提物各組分別給予海參精囊水提物[150、300、600 mg(生藥)/kg]、海參精囊醇提物[150、300、600 mg(生藥)/kg],陽性對(duì)照組灌胃甲睪酮溶液(1.5 mg/kg),空白組和模型組灌胃同體積的蒸餾水,連續(xù)4周。

    2.3 指標(biāo)的測(cè)定

    在小鼠飼養(yǎng)過程中,每組會(huì)有1~2 只死亡。為方便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述,故統(tǒng)一測(cè)定10只小鼠的指標(biāo)。末次給藥24 h后,頸椎脫臼處死小鼠,立即去雙側(cè)睪丸和附睪稱質(zhì)量,觀察睪丸、附睪臟器指數(shù)的變化(睪丸、附睪與體質(zhì)量的比值)。另取右側(cè)睪丸組織,按質(zhì)量(g)∶體積(ml)=1 ∶9的比例加入9倍體積的0.9%氯化鈉溶液,冰水浴條件下勻漿,制備成10%的勻漿液,2 500~3 000 r/min離心10 min,取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法檢測(cè)。睪丸組織總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定,T-SOD 活性采用羥胺法測(cè)定,GSH-PX 活性采用比色法測(cè)定,MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    3 結(jié)果

    3.1 海參精囊提取物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

    與空白組比較,模型組小鼠的睪丸及附睪的臟器指數(shù)明顯減小,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05);與模型組比較,給藥各組小鼠的臟器指數(shù)均明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05);其中,附睪質(zhì)量和附睪指數(shù)呈現(xiàn)出量效關(guān)系,結(jié)果見表1。

    表1 海參精囊提取物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(,n=10)Tab 1 Effects of holothurian spermatophore extracts on viscera indexes of mice(,n=10)

    表1 海參精囊提取物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(,n=10)Tab 1 Effects of holothurian spermatophore extracts on viscera indexes of mice(,n=10)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01Note:vs.blank group,*P<0.05,**P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01

    3.2 相關(guān)氧化指標(biāo)的檢測(cè)

    3.2.1 睪丸組織蛋白濃度的檢測(cè)結(jié)果 模型組小鼠經(jīng)CP 處理后,睪丸組織中蛋白濃度明顯降低,與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,給藥各組小鼠的睪丸組織蛋白濃度均升高(P<0.01或P<0.05),結(jié)果見表2。

    3.2.2 T-SOD的檢測(cè)結(jié)果 連續(xù)應(yīng)用5 d CP,導(dǎo)致小鼠睪丸組織中T-SOD 含量顯著降低;而海參精囊兩種提取物均逆轉(zhuǎn)了T-SOD的下降,使組織內(nèi)T-SOD含量顯著回升,均接近或超過空白組水平,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),結(jié)果見表2。

    表2 海參精囊提取物對(duì)小鼠睪丸組織抗氧化能力的影響(,n=10)Tab 2 Effects of holothurian spermatophore extracts on anti-oxidative capacity of testis(,n=10)

    表2 海參精囊提取物對(duì)小鼠睪丸組織抗氧化能力的影響(,n=10)Tab 2 Effects of holothurian spermatophore extracts on anti-oxidative capacity of testis(,n=10)

    注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01Note:vs.blank group,*P<0.05,**P<0.01;vs.model group,#P<0.05,##P<0.01

    3.2.3 GSH-PX 的檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)檢測(cè),連續(xù)5 d 注射CP,使睪丸組織中GSH-PX顯著下降,模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);海參精囊兩種提取物的使用顯著提高了組織中GSH-PX 的水平,與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),結(jié)果見表2。

    3.2.4 MDA的檢測(cè)結(jié)果 CP處理后,模型組小鼠睪丸組織中MDA含量顯著上升,其變化趨勢(shì)與T-SOD和GSH-PX相反,與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。海參精囊兩種提取物均顯著降低睪丸組織中MDA含量,與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05),結(jié)果見表2。

    4 討論

    “自由基”學(xué)說是國內(nèi)外研究的衰老理論的一種,最早是由Denham Harman 于1955 年提出的:氧自由基在機(jī)體的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生,然后與核酸蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)反應(yīng),生成相應(yīng)的氧化物和過氧化物[5-6]。在正常生理?xiàng)l件下,機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)維持在動(dòng)態(tài)平衡條件下,生物體內(nèi)的自由基不斷產(chǎn)生,也不斷被抗氧化系統(tǒng)清除[7]。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)主要包括酶促和非酶促兩個(gè)體系,其中酶促防御系統(tǒng)是通過體內(nèi)的各種抗氧化酶來抑制不同自由基和活性氧的產(chǎn)生,包括SOD、GSH-PX和過氧化氫酶(CAT)。SOD是歧化超氧陰離子(O2-)的專一性酶,由于O2-是活性氧生成過程中的初始產(chǎn)物,并對(duì)GSH-PX、CAT 將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 的反應(yīng)具有催化作用,因此,SOD 被稱作活性氧防御的第一線。GSH-PX 和CAT 主要起到后背支持的作用,其活性高低均反映出機(jī)體內(nèi)抗氧化水平。另外,MDA是氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的主要最終代謝產(chǎn)物,可以用來作為衡量氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)[8-9]。

    隨著年齡增加,機(jī)體清除自由基的能力降低,打破了氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡,主要表現(xiàn)為氧化作用增強(qiáng)、抗氧化能力減弱、自由基過量而產(chǎn)生過氧化脂肪,從而引起機(jī)體的損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組小鼠睪丸組織T-SOD、GSH-PX 活性和睪丸、附睪指數(shù)顯著降低,MDA水平顯著升高,提示CP可以導(dǎo)致睪丸組織細(xì)胞中氧自由基生成增多。T-SOD 和GSH-PX 被大量消耗,不能使過量生成的自由基得以清除,從而加重了脂質(zhì)過氧化程度,使氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡、生殖細(xì)胞損傷及代謝障礙,進(jìn)而損傷生殖系統(tǒng),使小鼠的睪丸和附睪萎縮。與模型組比較,給藥各組小鼠睪丸組織T-SOD、GSH-PX活性和睪丸、附睪指數(shù)顯著增高,MDA 水平明顯降低,說明海參精囊提取物能很好地降低睪丸組織MDA 水平,防止氧自由基損傷,提高睪丸組織T-SOD 活性和GSH-PX 活性,提高組織細(xì)胞抗氧化和清除自由基的能力,從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡,減輕機(jī)體受自由基損傷的程度,對(duì)抗衰老小鼠睪丸和附睪的萎縮。

    本研究發(fā)現(xiàn),CP可以使睪丸組織脂質(zhì)過氧化水平上升、超氧化反應(yīng)加強(qiáng),這可能是造成睪丸損害的途徑之一,但也無法排除與非酶促防御系統(tǒng)存在失衡有關(guān)。海參精囊兩種提取物對(duì)CP誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷有保護(hù)作用。

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