葛根素的提取及對(duì)小鼠解酒護(hù)肝功能的鑒定

王　晶，李洪敏，艾　芳，曹　雄，吳愛娟，韓　琴　(.成都醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，四川 成都 65000；.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 65000)

葛根素的提取及對(duì)小鼠解酒護(hù)肝功能的鑒定

王晶1，李洪敏1，艾芳1，曹雄1，吳愛娟1，韓琴2(1.成都醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)，四川 成都 615000；2.成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川 成都 615000)

[摘要]目的提取葛根中的葛根素，HPLC法檢測(cè)提取的葛根素，并比較不同劑量的葛根素與解酒效果的相關(guān)性，評(píng)價(jià)不同劑量葛根素解酒護(hù)肝效果。方法在前期實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)條件下提取葛根素備用，HPLC法定性定量檢測(cè)葛根醇提物(PRE)，將雄性健康昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、陽性對(duì)照組、葛根素干預(yù)組(每組10只)。先給小鼠灌胃葛根提取物，30 min后灌胃白酒，觀察醉酒小鼠的醒酒時(shí)間及測(cè)定小鼠肝組織ADH、GOT、GPT含量變化，以探討葛根素對(duì)醉酒小鼠的影響。結(jié)果HPLC測(cè)定8倍體積分?jǐn)?shù)的70%乙醇，在60 ℃恒溫?fù)u床水浴提取30 min為葛根素提取的最優(yōu)條件；與陽性對(duì)照組相比,低、中、高劑量的葛根醇提物能顯著縮短醉酒小鼠的醒酒時(shí)間，中劑量的PRE能有效抑制酒精的吸收，降低肝組織中ADH、GOT、GPT的濃度，而高劑量的PRE對(duì)酒精的吸收影響較小。結(jié)論HPLC法能對(duì)葛根素提取物進(jìn)行定性定量測(cè)定;葛根素對(duì)急性酒精中毒導(dǎo)致的小鼠肝損傷有保護(hù)性調(diào)控作用，葛根素劑量與解酒效果呈良好的正性相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]葛根素；HPLC；解酒護(hù)肝；急性酒精中毒

傳統(tǒng)中藥葛根有解酒功效，葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有解肌退熱、生津、透疹、升陽止瀉等功效[1]，屬于無毒中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明葛根具有提高肝細(xì)胞的再生能力，恢復(fù)肝臟正常機(jī)能，預(yù)防肝臟脂肪堆積；促進(jìn)新陳代謝，增強(qiáng)肝臟解毒功能，預(yù)防酒精對(duì)肝臟的損傷；改善心肌缺血狀態(tài)，防治心血管疾??；改善腦缺血狀態(tài)，防治腦血管疾?。粡?qiáng)化肝膽細(xì)胞自身免疫力，抵抗病毒入侵等作用功效。葛根的主要成分為異黃酮類、葛根苷類、三帖皂苷類、生物堿及其他化合物4類[2]。在葛根的有效成分中，異黃酮類最受關(guān)注，其中又以葛根素研究更受關(guān)注。葛根素可防治慢性乙醇中毒引起的記憶減退，提高腦SOD活性，從而減少腦內(nèi)脂褐素積累，逆轉(zhuǎn)乙醇導(dǎo)致的海馬突觸界面細(xì)微結(jié)構(gòu)的衰退性變化[3]。目前，過量飲酒及酗酒的現(xiàn)象日益明顯，酒精性肝病的發(fā)病率逐年攀升。乙醇的氧化代謝解毒過程絕大多數(shù)于肝臟中進(jìn)行，其在肝臟中主要代謝生成活性中間產(chǎn)物乙醛和多種氧自由基。乙醛能在黃嘌呤氧化酶作用下形成超氧化物，引起脂質(zhì)過氧化，直接導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)線粒體受損[4]。此外，乙醛還可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成乙醛復(fù)合物，致使蛋白質(zhì)功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞再次受損[5]。乙醛經(jīng)與肝臟谷胱甘肽(GSH)結(jié)合反應(yīng)最終生成乙酸解毒，而自由基則繼續(xù)氧化細(xì)胞膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的損害。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)的升高可以直接反映肝臟的受損情況，是肝細(xì)胞損害的“金標(biāo)準(zhǔn)”。為此，我們對(duì)葛根主要提取物葛根素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，為其解酒護(hù)肝的臨床應(yīng)用，以及為低值葛根的高值化利用提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量25～35 g，購自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；野葛根購于太極大藥房(安國市藺氏藥材有限責(zé)任公司)；ADH、GOT、GPT試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司。52°紅星牌二鍋頭酒、甲醇為色譜純、肝素鈉、氯化鈉、乙醇等均為分析醇。

電子天平FA2104(上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司)；高效液相色譜儀LC-20A/10A(杭州瑞析科技有限公司 )；離心機(jī)TD5G(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；數(shù)顯水浴恒溫振蕩器SHA-CA/SHZ-82往復(fù)(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-5203(常州杰博森儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀DNM-9602A(北京普朗新技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1葛根醇提物(PRE)的制備將葛根干燥，粉碎后過藥典2號(hào)篩。根據(jù)前期響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱取葛根粉末置于錐形瓶中，加8倍體積分?jǐn)?shù)的70%乙醇，在70 ℃恒溫?fù)u床水浴提取30 min。分液漏斗過濾，取濾液，在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以20 r/min旋蒸濃縮去乙醇。

1.2.2HPLC對(duì)PRE定性分析以及測(cè)定PRE中葛根素含量精密稱取葛根素適量，加95%的乙醇溶解，配制成一定量的葛根素對(duì)照品液備用。取該對(duì)照品液分別配制成2、4、6、8、10 mg/L的葛根素標(biāo)品溶液。在流動(dòng)相為80%甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μl的條件下檢測(cè)葛根素標(biāo)品的出峰時(shí)間及峰面積，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，出峰時(shí)間為縱坐標(biāo)繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)PRE的出峰時(shí)間及峰面積計(jì)算PRE中葛根素的含量。

1.2.3小鼠急性酒精中毒模型制備取昆明種雄性小鼠40只，體質(zhì)量為25～35 g，隨機(jī)分5組，每組8只。禁食6 h后，各組小鼠分別按體質(zhì)量的10%、12%、15%、17%、20%灌胃52°飲用白酒，連續(xù)灌胃3 d，每次灌酒劑量減少為上次劑量的2/3，觀察小鼠醉酒表現(xiàn)，記錄小鼠醉酒時(shí)間，醒酒數(shù)以及死亡數(shù)。以確定最適醉酒劑量。

1.2.4小鼠急性酒精中毒酒醒指標(biāo)的測(cè)定取50只昆明雄性小鼠，體質(zhì)量25～35 g，隨機(jī)分為5組，每組10只。空白組：1 g/kg PRE等量的生理鹽水+體質(zhì)量的15% mL/kg的白酒等量的生理鹽水。對(duì)照組：1 g/kg PRE等量的生理鹽水+體質(zhì)量的15% mL/kg的白酒；低劑量組：0.5 g/kg PRE+體質(zhì)量的15% mL/kg的白酒；中劑量組：1 g/kg PRE+體質(zhì)量的15% mL/kg的白酒；高劑量組：1.5 g/kg PRE+體質(zhì)量的15% mL/kg的白酒。醒酒指標(biāo)的確定：翻正反射小時(shí)時(shí)間以小鼠背部向下保持30 s為標(biāo)準(zhǔn)；醒酒時(shí)間以活動(dòng)自如、靈活、精神，即翻正反射恢復(fù)的時(shí)候；醉酒時(shí)間=翻正反射恢復(fù)時(shí)間-翻正反射小時(shí)時(shí)間；醒酒時(shí)間=翻正恢復(fù)時(shí)間-給酒時(shí)間，醒酒時(shí)間是醉酒潛伏期和睡眠時(shí)間的綜合體現(xiàn)。

1.2.5小鼠急性酒精中毒肝組織中的ADH、GOT、GPT的測(cè)定在連續(xù)灌胃3 d后，第3次醒酒后立即斷頸處死，取肝右葉制備組織勻漿進(jìn)行測(cè)定。肝組織ALT活力測(cè)定：準(zhǔn)確稱取肝組織質(zhì)量，按質(zhì)量(g)︰體積(mL)=1︰9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水條件下機(jī)械勻漿，制備10%的組織勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液，再用生理鹽水10倍稀釋成1%的濃度待測(cè)。肝組織ADH活力測(cè)定：準(zhǔn)確稱取肝組織質(zhì)量，按質(zhì)量(g)︰體積(mL)=1︰9的比例，加入9倍體積的生理鹽水制備10%的組織勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清進(jìn)行測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1小鼠模型制備結(jié)果

15%的灌胃劑量能使實(shí)驗(yàn)小鼠的醉酒率最高而死亡率最低。在15%的灌胃劑量下成功6只，死亡1只(酒精不耐受)。因此選擇此劑量作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最適醉酒劑量。

2.2HPLC法對(duì)葛根素提取物定量定性分析

檢測(cè)波為250 nm時(shí),HPLC測(cè)得PRE的出峰時(shí)間為2.6 min，經(jīng)與標(biāo)品對(duì)比為葛根素，見圖1?；貧w方程為Y=-7.253e+0.04+7.122e+004X，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 262，見圖2。將旋蒸濃縮后的PRE稀釋10 000倍后用HPLC法計(jì)算其濃度，最后得旋蒸后醇提物的濃度為136 mg/mL。

2.3葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠醒酒時(shí)間的影響

葛根各實(shí)驗(yàn)組葛根素醇提物能顯著縮短急性酒精中毒小鼠的醒酒時(shí)間(P<0.05)，且能延長(zhǎng)小鼠的醉酒潛伏時(shí)間，縮短睡眠時(shí)間，與陽性對(duì)照組相比存在顯著差異(P<0.05)，且PRE的濃度越高，預(yù)防醉酒的效果越好(表1)。

表1　葛根素的抗醉酒實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s)

*：與陽性對(duì)照組比較，P<0.05

圖1HPLC在檢測(cè)波為250 nm時(shí)所得的葛根素標(biāo)準(zhǔn)液與葛根素醇提物的出峰時(shí)間

圖2　葛根素標(biāo)線

2.4各組肝勻漿GPT、GOT、ADH的比較

與空白組比較，模型組GPT、GOT、ADH水平均有明顯升高(P<0.05)，各給藥組較陽性對(duì)照組有明顯降低(P<0.05)；各給藥組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表2。

表2　各肝組織ALT、AST的變化

*:與空白組比較，P<0.05；#：與陽性對(duì)照組相比,P<0.05

3討論

人體攝入乙醇后,作為人體的重要解毒器官，乙醇的解毒代謝90%都是以肝內(nèi)氧化的方式在體內(nèi)進(jìn)行的[6]，其余10%則是通過呼氣、尿、出汗等形式排泄到體外。大量飲酒或長(zhǎng)期酗酒，超過肝臟正常代謝解毒能力，乙醇在血液和肝臟中大量的蓄積。肝內(nèi)蓄積的乙醇及其Ⅱ相反應(yīng)產(chǎn)物直接刺激機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)毒素，內(nèi)毒素刺激肝臟Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥因子，直接引起肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥、壞死和導(dǎo)致肝細(xì)胞缺氧，最終導(dǎo)致酒精性肝病的發(fā)生[7]。乙醇脂溶性大，體內(nèi)蓄積的乙醇可透過血腦屏障入腦，抑制運(yùn)動(dòng)中樞和呼吸中樞興奮，嚴(yán)重的急性中毒可發(fā)生呼吸、循環(huán)衰竭。乙醇進(jìn)入人體后主要途徑：①部分乙醇在胃黏膜ADH作用下首過消除；②肝細(xì)胞胞漿內(nèi)的ADH氧化反應(yīng)；③肝微粒體內(nèi)的乙醇氧化酶系統(tǒng)(MEOS)。④肝過氧化酶體內(nèi)的觸酶四條途徑進(jìn)行代謝[8]。葛根具有多種藥理作用，而解酒功能主要機(jī)理在于葛根素參與肝臟的代謝過程。葛根素能夠在乙醇的腸胃吸收及代謝解毒兩個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮可使血中乙醇、乙醛濃度下降，抑制尿素氮( BUN)的升高，從而起到解酒作用[9]。葛根素通過抗自由基，可以減少自由基對(duì)肝細(xì)胞膜的破壞作用，同時(shí)葛根素能有效降低酒精性肝損傷模型大鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平，一定程度上抑制酒精導(dǎo)致的肝纖維化的產(chǎn)生[10]，從而預(yù)防醉酒引起的急性酒精性肝損傷。

本實(shí)驗(yàn)在HPLC法對(duì)葛根醇提物進(jìn)行定性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣速度影響出峰時(shí)間，因此進(jìn)樣時(shí)需迅速。對(duì)葛根的處理?xiàng)l件能直接影響葛根素的提取量，其原理為：葛根中含有大量的淀粉，所以在提取時(shí)應(yīng)注意避免高溫使淀粉糊化。粉碎能增大葛根表面積，加快浸出速度，所以提取葛根素時(shí)一定要盡量將葛根破碎。檢測(cè)波長(zhǎng)選擇，制備葛根素標(biāo)準(zhǔn)液，參照紫外-可見分光光度法，于190～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描，記錄吸收光譜。于250 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，故選用250 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間均對(duì)葛根素的提取有一定影響，經(jīng)方差分析，提取時(shí)間、料液比對(duì)提取效果影響不顯著，乙醇的體積分?jǐn)?shù)則有顯著影響 。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，PRE各劑量組均能延長(zhǎng)醉酒小鼠的醉酒潛伏期，減少睡眠時(shí)間，縮短醒酒時(shí)間起到預(yù)防醉酒的效果。其機(jī)制為葛根素抑制了消化道對(duì)乙醇的吸收，加強(qiáng)了乙醇在胃腸道的首過消除，從而減小了乙醇生物利用度[12]。肝臟含酶豐富，由陽性對(duì)照組得知，當(dāng)肝臟受到實(shí)質(zhì)性損害時(shí)，會(huì)引起肝勻漿中GPT、GOT濃度升高。PRE各劑量組可使肝勻漿中GPT、GOT濃度受抑制，表明葛根素能有效地提高機(jī)體抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而降低酒精對(duì)肝臟的損傷。其作用機(jī)制為葛根素促了機(jī)體進(jìn)新陳代謝，增加肝臟乙醇代謝解毒速度[12]。減少乙醇在機(jī)體的蓄積，從而降低血中乙醇濃度，減輕乙醇對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等的損害，起到有效的降醇解酒護(hù)肝作用。但并非PRE劑量越大肝勻漿中GPT、GOT濃度越小，劑量越大效果越好，說明用藥劑量要恰當(dāng)。

本研究分析了葛根的解酒預(yù)防效果，通過醒酒時(shí)間個(gè)肝組織中酶的變化的處以下結(jié)論：①葛根素對(duì)急性酒精中毒小鼠具有明顯的解酒預(yù)防效果，能延長(zhǎng)醉酒小鼠的醉酒潛伏期，減少睡眠時(shí)間，縮短醒酒時(shí)間和保護(hù)肝臟。②PRE各劑量組肝勻漿中GPT、GOT濃度均受抑制，表明葛根具有素具有降低酒精對(duì)肝臟的損傷的作用。其作用機(jī)制與提高肝臟GPT和GOT活力，加速乙醇的代謝過程，提高肝臟抗氧化能力，降低氧自由基對(duì)肝細(xì)胞膜上脂質(zhì)和蛋白的損傷，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性有關(guān)。葛根素的解酒效果與葛根素的含量有一定的相關(guān)性，隨著葛根素?cái)z入劑量的增加，醉酒小鼠的醒酒時(shí)間降低。本實(shí)驗(yàn)為葛根素作解酒護(hù)肝的臨床應(yīng)用，以及低值葛根的高值化加工和利用提供了理論依據(jù)。

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(編輯：左艷芳)

Puerarin extraction and identification of solution wine to protect liver function in mice

WANG Jing1,LI Hong-min1,AI Fang1,CAO Xiong1,WU Ai-juan1,HAN Qin2(1.Preventive Medicine,Chengdu Medical College,Chengdu Sichuan 615000;2.Department of public health,Chengdu Medical College,Chengdu Sichuan 615000,China)

Abstract:ObjectivePueraria extract puerarin,HPLC assay puerarin extract and compare different doses of correlation with the hangover effect of puerarin evaluate different doses of puerarin liver hangover effect. MethodsExtracted under optimal conditions obtained in the previous experiment puerarin spare,HPLC method for qualitative and quantitative detection of alcohol extract of kudzu root (PRE),the male Kunming mice were randomly divided into control group,positive control group and puerarin group,each group of 10.Give mice fed pueraria extract,30 min after administration of liquor,drunk mice sobering observation time and the determination of mouse liver ADH,GOT,GPT content in order to investigate the effect of puerarin on drunken mice. ResultsHPLC fraction was measured at 8 times the volume of 70% ethanol,60 ℃ constant temperature water bath shaker at 30 min for optimal extraction conditions puerarin extraction.Compared with the positive control groups:low,medium and high doses of alcohol extract of pueraria can significantly shorten the time to sober up drunken mice,the dose of PRE could effectively inhibit the absorption of alcohol,reduce liver tissue ADH,GOT,GPT,the effects of high doses of PRE absorption of alcohol was small. ConclusionHPLC method capable of puerarin extract the qualitative and quantitative determination of puerarin on liver injury caused by acute alcoholism a protective regulatory role,and the hangover effect of puerarin dose showed a good positive correlation.

Keywords:puerarin extraction;HPLC;protect liver therapy;acute alcoholism

[收稿日期]2015-03-17[修回日期] 2015-04-15

[通訊作者]韓琴，E-mail:16964791@qq.com

[基金項(xiàng)目]四川省廳級(jí)川菜發(fā)展研究項(xiàng)目(CC13Z08)

doi:10.11659/jjssx.12E014060

[中圖分類號(hào)]R931.6；R34

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)04-0358-04