洞庭青鯽(Carassius auratus var. Dongtingking)與三個鯽品系群體遺傳多樣性的ISSR分析*

劉良國 楊品紅 謝春華 王曉艷 徐黎明

(湖南省水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心 動物學(xué)湖南省高校重點實驗室 湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 常德 415000)

洞庭青鯽(Dongtingking crucian carp, Carassius auratus var. Dongtingking, 暫命名)是近年來在洞庭湖區(qū)澧水北民湖水域發(fā)現(xiàn)的天然二倍體鯽魚(2N=100)新品系(楊品紅等, 2005a)。因其具有生長速度快、養(yǎng)殖產(chǎn)量高、抗逆性強、原汁原味等綜合性狀優(yōu)勢, 深受廣大漁農(nóng)和消費者青睞, 具有極為廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用前景。在前期的工作中, 作者從形態(tài)特征、染色體組型、生殖方式等方面對洞庭青鯽進行了研究(楊品紅等, 2005b, 2007; 吳珊等, 2006), 初步證實洞庭青鯽是一個具有兩性繁殖方式、形態(tài)性狀和染色體數(shù)目穩(wěn)定的二倍體(2N=100)鯽魚品系。與已報道的眾多鯽品系相比較, 洞庭青鯽與 2個鯽品系性狀較為相似:一是彭澤鯽, 二是普通的野鯽。彭澤鯽原產(chǎn)于江西省彭澤縣丁家湖、芳湖和太白湖等天然水域, 最初江西省水產(chǎn)研究所認(rèn)為彭澤鯽也是二倍體(2N=100)兩性生殖魚類(傅永進, 1996), 但隨后報道的彭澤鯽均為染色體數(shù)目在 150條左右的雌核發(fā)育魚(Zhou et al,2002; 劉良國等, 2004)。洞庭青鯽與最初報道的彭澤鯽一樣, 也是行兩性生殖方式的二倍體鯽魚種群。另外, 作者對洞庭湖區(qū)普通野鯽的染色體組型進行研究, 結(jié)果表明在洞庭湖區(qū)同時存在染色體數(shù)為100和150±而且在形態(tài)上無法區(qū)分的兩種倍性野鯽群體(劉良國等, 2012)。因此, 從洞庭青鯽的來源和染色體倍性上看, 它又與洞庭湖區(qū)的野鯽具有一定的相似性。為了進一步了解洞庭青鯽這一新型鯽魚品系的遺傳結(jié)構(gòu)特征, 揭示不同鯽品系之間的遺傳關(guān)系, 有必要從分子生物學(xué)的角度對洞庭青鯽和三個與之性狀較為相似的彭澤鯽(C. auratus var. Pengze)、野生二倍體和三倍體鯽進行比較分析。

ISSR (inter-simple sequence repeat, 單一的序列重復(fù)區(qū)間)分子標(biāo)記是在SSR標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種實驗技術(shù)(Zietikiewicz et al, 1994), 它結(jié)合了SSR和RAPD技術(shù)的優(yōu)點, 具有模板需要量少、多態(tài)性豐富、實驗成本低、操作簡單、實驗穩(wěn)定性較高等優(yōu)點, 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于物種的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系的分析、遺傳多樣性與進化等研究領(lǐng)域(Kojima et al,1998; Reddy et al, 2002; Jian et al, 2004; Ai et al,2006)。本實驗采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù), 分析了洞庭青鯽種群與其它鯽品系的分子遺傳多樣性, 對于探討鯽魚乃至脊椎動物多倍體的起源與進化機制具有一定的理論意義, 同時對二倍體洞庭青鯽種質(zhì)資源的保護及育種實踐、養(yǎng)殖發(fā)展也具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用洞庭青鯽(F6)和彭澤鯽取自大湖股份湖南省水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心實驗基地, 所用二倍體和三倍體野鯽采自洞庭湖區(qū)的沅水和澧水水域。在通過腎細(xì)胞染色體活體制片方法, 確定不同鯽品系的染色體倍性后, 每個鯽品系各取樣 30尾, 分別剪其背部肌肉用95%乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA提取

取1.0g肌肉提取基因組DNA, 參照常規(guī)的酚-氯仿抽提程序進行。提取后的DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量, 用紫外分光光度計估算濃度和純度, 調(diào)整濃度至40ng/μL, 4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR-PCR擴增

采用加拿大British Columbia大學(xué)公布的ISSR引物序列, 由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系為 25μL, 其中 40ng/μL DNA 模板 2.0μL, 10μmol/L ISSR 引物 1.0μL, 2.5 mmol/L dNTPs 2.5μL, 10× PCR buffer 2.5μL, Taq DNA polymease 1.0μL (1U/μL), ddH2O 16μL。PCR 擴增程序為: 95°C 5 min, 接著 95°C 30 s, 52°C 45 s, 72°C 2 min,共45個循環(huán), 最后72°C 10 min。擴增產(chǎn)物在4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳(50 W恒功率2.5 h), ABI PRISM 377測序儀掃描, 得到電泳圖。并以50—1000 bp標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量進行對照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用GENESCAN3.1軟件打開由ABI PRISM 377測序儀掃描得到的電泳圖, 對膠圖進行數(shù)據(jù)提取, 得到各片段大小的結(jié)果, 導(dǎo)出結(jié)果并將結(jié)果保存為XLS格式, 對EXCEL表內(nèi)數(shù)值進行0/1賦值記帶, 形成由“l(fā)”和“0”組成的原始二元數(shù)據(jù)矩陣。

根據(jù) Apostol等(1996)的假設(shè), 將每個條帶視為一個位點進行多態(tài)分析, 多態(tài)位點比例(P) = 多態(tài)位點數(shù)/總位點數(shù)×100%。由Lynch(1990)的方法計算群體內(nèi)、群體間的遺傳相似指數(shù)和遺傳距離: 兩個體間的遺傳相似指數(shù)Sxy= 2Nxy/ (Nx+ Ny), 其中Nxy表示個體x和y之間共有的DNA擴增片段數(shù), Nx和Ny分別是個體x和y的DNA擴增片段數(shù)。群體內(nèi)的遺傳相似指數(shù) S為群體內(nèi)所有的兩個體間遺傳相似指數(shù)的平均值, 群體內(nèi)的遺傳距離D = 1－S; 群體間的遺傳相似指數(shù)Sij為群體i和群體j中所有隨機配對的兩個體間遺傳相似指數(shù)的平均值, 群體間的遺傳距離Dij= 1–Sij。

1.5 聚類分析

根據(jù)各樣本之間的遺傳距離, 用MEGA4軟件包中的UPGMA (unweighted pair-group methods with arithmetic means)方法進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 ISSR-PCR擴增結(jié)果

從96個ISSR引物中, 篩選出擴增結(jié)果穩(wěn)定、多態(tài)型高、重復(fù)性好的引物9個。9個引物在四個鯽品系群體中共檢測到 1637個擴增位點, 片段大小在75—1000 bp之間, 每個引物檢測出的位點數(shù) 141—232個不等(圖1)。在1637個擴增位點中, 多態(tài)位點數(shù) 1572個, 多態(tài)位點比例 96.03%, 不同引物擴增出的多態(tài)位點比例均在 90%以上(表 1), 表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。

2.2 群體內(nèi)的遺傳多樣性

對四個鯽品系群體內(nèi)的擴增條帶(位點)進行統(tǒng)計分析, 得到四個鯽品系群體的多態(tài)位點比例和遺傳距離(表 2)。從多態(tài)位點比例和遺傳距離數(shù)據(jù)指標(biāo)來看, 洞庭青鯽群體明顯低于二倍體鯽和三倍體鯽兩個群體(P＜0.05), 而與彭澤鯽群體的差異不顯著(P＞0.05)。表明洞庭青鯽、彭澤鯽等選育養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性明顯低于野生鯽群體。而在野生鯽群體中,又以三倍體鯽群體的遺傳多樣性最高。

2.3 群體間的遺傳相似系數(shù)與遺傳距離

四個鯽品系群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表 3。計算結(jié)果表明, 四個群體之間的平均遺傳相似系數(shù)在 0.8622—0.8809, 平均遺傳距離為 0.1191—0.1378。其中洞庭青鯽與彭澤鯽的遺傳相似系數(shù)最高(0.8809), 遺傳距離最小(0.1191); 而二者與三倍體鯽的遺傳相似系數(shù)最小(均為0.8622), 遺傳距離最遠(yuǎn)(均為 0.1378)。

圖1 引物(GA)8YT和(CTTCA)3對四個鯽品系群體的ISSR擴增圖譜Fig.1 The ISSR amplified results for the population of 4 strains of crucian carp by the primer (AG)8YT and (CTTCA)3 M. ROX1000 Ladder marker; 1—7. 洞庭青鯽; 8—14. 二倍體野鯽; 15—21. 三倍體野鯽; 22—28. 彭澤鯽

2.4 聚類分析

根據(jù)四個鯽品系群體間的遺傳距離數(shù)據(jù), 采用MEGA 4軟件包中的 UPGMA方法進行聚類分析,得到四個鯽品系群體的 UPGMA分支樹狀圖(圖 2),結(jié)果為洞庭青鯽與彭澤鯽聚成一個分支, 二倍體鯽與三倍體鯽聚成一個分支, 然后兩個分支再聚合在一起。

3 討論

3.1 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在不同鯽品系遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

采用ISSR分子標(biāo)記對種群遺傳多樣性進行分析時, 由于 ISSR引物可以與整個基因組內(nèi)多個位點進行雜交, 因此可以獲得大量的遺傳信息, 在同一物種內(nèi)的不同品系或群體的遺傳多樣性研究中, 是一種非常有效的手段(Kol et al, 2007)。鯽(C. auratus)是一Liu等(2009)、高麗霞等(2011)用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光檢測淇河鯽、野鯽和紅鯽的ISSR研究結(jié)果。本實驗結(jié)果表明, 在對不同鯽品系群體進行遺傳多樣性分析時, 采用 ISSR技術(shù)比 RAPD技術(shù)更為高效,更能揭示它們之間的遺傳差異, 這與兩種標(biāo)記的檢測位點不同有關(guān), RAPD標(biāo)記是對生物基因組的隨機個分布廣泛、適應(yīng)性強、多樣性高、遺傳背景復(fù)雜的類群(肖俊等, 2010), 采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對不同鯽種群的遺傳多樣性研究已有報道: 如 Liu等(2009)利用12個ISSR引物對異源四倍體鯽鯉及其原始親本紅鯽和鯉魚群體進行分析, 高麗霞等(2011)用 8個ISSR引物對淇河鯽和兩個野生鯽魚群體進行擴增,均檢測出非常豐富的遺傳多樣性。

表1 ISSR引物在四個鯽品系群體中檢測的多態(tài)位點數(shù)及多態(tài)位點比例Tab.1 Number of polymorphic loci and the percentage in the population of the 4 strains of crucian carp with a single primer by ISSR analysis

表2 四個鯽品系群體內(nèi)的遺傳多樣性Tab.2 The genetic diversities within the population of 4 strains of crucian carp

表3 四個鯽品系群體間的遺傳相似系數(shù)(對角線上方)和遺傳距離(對角線下方)Tab.3 The genetic similarities (above diagonal) and genetic distances (below diagonal) among the 4 strains of crucian carp

圖2 四個鯽品系群體的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for the 4 strains of crucian carp

本實驗采用9個ISSR引物對四個鯽品系群體進行擴增, 在四個鯽品系群體中, 平均每個 ISSR引物擴增的位點數(shù)為182, 多態(tài)位點為175。9個ISSR引物共擴增出 1637個條帶, 其中單態(tài)位點只有 65個,其余1572個為多態(tài)位點, 多態(tài)位點比例高達96.03%,高于Zhou等(2000)用RAPD技術(shù)研究銀鯽、劉良國等(2008)用 RAPD 技術(shù)研究彭澤鯽的結(jié)果, 也高于選擇擴增, 而 ISSR標(biāo)記是檢測基因組內(nèi)廣泛存在的微衛(wèi)星DNA片段和間隔區(qū)DNA (Mattioni et al, 2002);同時, 擴增片段的不同電泳檢測方法也直接影響到遺傳多樣性結(jié)果。本實驗的 ISSR擴增片段是在 4%的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳后, 再采用 ABI PRISM 377自動測序儀對膠圖上的條帶進行掃描檢測(可以檢測出兩個堿基差異大小的片段), 與瓊脂糖凝膠電泳和普通的紫外光電泳檢測相比, 檢測出的基因片段數(shù)目更多、多態(tài)性更為豐富。綜上所述, 采用本實驗方法, 能夠更加高效地對同為一個物種的不同鯽品系群體遺傳多樣性進行檢測。

3.2 不同鯽品系群體的遺傳關(guān)系和資源保護

洞庭青鯽是從天然水域中選育的二倍體鯽魚新品系, 經(jīng)過連續(xù)7代的人工選育, 其遺傳性狀已趨于穩(wěn)定。從表2可見, 在四個鯽品系群體中, 洞庭青鯽群體內(nèi)的多態(tài)位點比例、遺傳距離值均為最低, 說明了其遺傳性狀的相對穩(wěn)定。彭澤鯽也是人工養(yǎng)殖的群體, 其種群內(nèi)的遺傳多樣性只略高于洞庭青鯽, 這可能與其在雌核生殖的過程中, 彭澤鯽卵子接受了少量異源精子基因有關(guān)。與洞庭青鯽、彭澤鯽品系相比,野生鯽品系的遺傳多樣性明顯偏高, 其中三倍體鯽的遺傳多樣性又高于二倍體鯽, 這可能與野生鯽品系采自洞庭湖水系天然水體, 不同個體或物種之間存在基因交流有關(guān)。筆者曾經(jīng)對洞庭湖水系兩種不同倍性野鯽的數(shù)量和生殖方式進行研究(劉良國等,2012), 發(fā)現(xiàn)二倍體鯽所占比例(15%)遠(yuǎn)小于三倍體鯽(85%), 認(rèn)為三倍體鯽是一種行雌核發(fā)育生殖方式的鯽, 其卵子無論是與同源還是異源精子結(jié)合, 都能產(chǎn)生正常的三倍體鯽后代; 而二倍體鯽是行兩性生殖方式的鯽, 其卵子只有與二倍體鯽的精子結(jié)合, 才能產(chǎn)生正常的二倍體后代。由于三倍體鯽在生殖過程中存在異精雌核發(fā)育的現(xiàn)象, 因此, 本實驗檢測出三倍體鯽的遺傳多樣性高于二倍體鯽。

Thorp(1982)的研究認(rèn)為, 不同物種間的遺傳相似系數(shù)I = 0.2—0.8 (遺傳距離D = 0.2—0.8), 同科屬群體間I = 0.1—0.5 (D = 0.5—0.9), 同種群體間I =0.8—0.97 (D = 0.03—0.2)。本實驗研究表明, 四個鯽品系群體之間的遺傳相似系數(shù)在0.8622—0.8809 (遺傳距離為 0.1191—0.1378), 符合同種群體間的遺傳相似系數(shù)范圍, 說明四個鯽品系仍然屬于同一個物種C. auratus。四個鯽品系群體間的遺傳距離和聚類分析表明, 洞庭青鯽和彭澤鯽之間、二倍體鯽和三倍體鯽之間的親緣關(guān)系較近, 而洞庭青鯽、彭澤鯽與二倍體鯽、三倍體鯽的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。洞庭青鯽與彭澤鯽均起源于天然水域的二倍體鯽, 因其都具有優(yōu)良的經(jīng)濟生長性狀而被多代人工選育, 因而在遺傳性狀上二者可能也具有較大的相似性, 表現(xiàn)出親緣關(guān)系較近; 野生二倍體和三倍體鯽生活于相同的水體, 二者在形態(tài)上很難區(qū)分, 據(jù)劉良國等(2012)報道, 三倍體鯽的來源可能是由于二倍體鯽因環(huán)境因素(如溫度的劇變等)產(chǎn)生二倍體的卵子, 這些二倍體卵子再與正常的單倍體精子雜交形成, 本實驗得出二者親緣關(guān)系較近與之相符。有報道表明(沈俊寶等,1983; 王蕊芳等, 1988), 由于環(huán)境急變或天然雜交等原因, 二倍體鯽可以特化成三倍體鯽, 由于三倍體鯽行雌核發(fā)育, 具有較強的繁殖力和適應(yīng)性, 因而種群上具有較強的優(yōu)勢, 這可能就是天然水域中三倍體鯽的比例遠(yuǎn)大于二倍體鯽的原因。最初發(fā)現(xiàn)的二倍體彭澤鯽現(xiàn)在都是行雌核發(fā)育的三倍體, 也可能與上述原因有關(guān)。據(jù)此推測, 二倍體洞庭青鯽一旦遭遇急劇的環(huán)境變化, 其中部分個體也有可能特化為行雌核發(fā)育生殖方式的三倍體, 進一步通過人工選育, 就有可能導(dǎo)致新的三倍體洞庭青鯽種群的形成和二倍體洞庭青鯽種群的消失。因此, 自然界中, 二倍體洞庭青鯽和二倍體野生鯽的存在就顯得尤為珍貴, 對二倍體鯽種質(zhì)資源的保護必須引起重視。

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