豬源肺炎克雷伯菌的分離鑒定

林星宇，王 印,2*，楊澤曉，姚學(xué)萍，胡 凌，彭善珍，陳 平，鄔旭龍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 雅安 625014)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae，Kpn)為革蘭氏陰性菌，屬于腸桿科克雷伯菌屬，能夠?qū)е氯诵蟀l(fā)病的機(jī)會(huì)致病菌[1]。該菌可以引起肺炎、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎，傷口感染和全身敗血癥等，發(fā)病死亡率極高[2]。近年來Kpn 耐藥性普遍存在，而且多為多重抗藥性，給臨床治療造成困難。

2014 年5 月，四川某豬場發(fā)生疫情，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，本研究通過病理剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)及16S rRNA 基因的擴(kuò)增測序，證明分離菌株為具有多重耐藥，培養(yǎng)特性發(fā)生改變，而且為毒力較強(qiáng)的Kpn 肺炎亞種。

1 材料和方法

1.1 病料樣品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 臨床樣品采集自四川省某豬場病死豬；健康小鼠(體質(zhì)量約20 g)購自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片及微量生化反應(yīng)管均購自杭州微生物試劑有限公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)、凝膠回收試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 分離培養(yǎng) 無菌采集病理剖檢有典型病理變化的豬肺臟樣品，經(jīng)姬姆薩染色鏡檢肺臟組織中帶菌情況，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化培養(yǎng)；然后接種于麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，同時(shí)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。并用5 %的兔鮮血平板鑒定其溶血性。

對(duì)各培養(yǎng)條件下細(xì)菌菌落進(jìn)行觀察，將分離株純培養(yǎng)物革蘭氏染色鏡鑒，觀察細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)及染色特征。

1.3 理化鑒定 將上述純培養(yǎng)得到的細(xì)菌接種于普通LB 中培養(yǎng)24 h，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌生化試驗(yàn)。

1.4 分子生物學(xué)鑒定 參照文獻(xiàn)[3]合成細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物16 SF(5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3')/16 SR(5'-GGTTACCTTGTTACGACT-3')，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以純培養(yǎng)細(xì)菌染色體DNA 為模板，擴(kuò)增16S rRNA 基因片段。PCR 反應(yīng)條件為94 ℃5 min；94 ℃45 s、55 ℃30 s、72 ℃、30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并純化回收目的片段由華大基因測序。

1.5 小鼠致病性試驗(yàn) 純化菌株在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，以無菌生理鹽水沖洗菌苔，采用麥?zhǔn)媳葷岱y定菌液濃度后稀釋至1×108cfu/mL。將8 只小鼠隨機(jī)分為兩組，每組4 只，腹腔注射菌液測定其致病力(0.2 mL/只)，對(duì)照組注射生理鹽水(0.2 mL/只)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定為高度敏感、中度敏感和不敏感。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢結(jié)果 對(duì)病死豬進(jìn)行剖檢可見肺臟出血水腫，機(jī)體其他組織器官和體表無明顯肉眼可見的病變。肺臟組織觸片后經(jīng)姬姆薩染色鏡檢，可見組織中有大量的卵圓形、球桿狀的菌體單個(gè)、成對(duì)或呈鏈狀排列。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 無菌操作取病死豬肺臟組織接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)分純培養(yǎng)顯示為半透明、灰白色、圓凸、閃光、表面濕潤的光滑型菌落，拉動(dòng)成絲線狀。在麥康凱平板發(fā)現(xiàn)形成隆起大而黏液樣、易融合的橙黃色菌落，邊緣有時(shí)為粉紅色(圖1A)；并且先為紅色菌落，后變?yōu)槌赛S色菌落，與以往分離的Kpn 也有差異[4-7]，表明該分離菌代謝機(jī)制與以往Kpn 分離菌有所不同。血平板上形成較大、圓凸、灰白色的菌落，并呈現(xiàn)α 溶血現(xiàn)象。在光學(xué)顯微鏡下可見該菌為革蘭氏陰性桿菌,呈卵圓形或球桿狀，單個(gè)或成雙排列(圖1B)。

圖1 分離菌株在麥康凱和血平板培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Cultivation results of isolated bacterial strains on MacConkey and blood agar

2.3 細(xì)菌的理化鑒定 以無菌生理鹽水沖洗菌苔，將菌液接種于生化管中進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果詳見表1。培養(yǎng)特性結(jié)果顯示，該菌為兼性厭氧發(fā)酵型無運(yùn)動(dòng)能力的G-桿菌。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參考文獻(xiàn)[8-9]，表明該分離菌株為Kpn 肺炎亞種。

2.4 分離株的16S rRNA擴(kuò)增及測序鑒定結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳檢測16S rRNA 的擴(kuò)增片段約1 500 bp，與預(yù)期目的片段大小一致(圖2)。將純化回收的目的片段測序結(jié)果經(jīng)BLAST 分析比對(duì)顯示該菌株16S rRNA 基因部分序列與肺炎克雷伯菌同源性達(dá)99 %(KM272989)，確定該分離菌株為Kpn。

表1 分離菌的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics test of the isolate

圖2 分離菌株16S rRNA 序列PCR 擴(kuò)增Fig.2 Amplification of 16S rRNA from the isolate by PCR

2.5 小鼠致病性試驗(yàn) 人工感染組小鼠于接種6 h后，開始表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，在接種后24 h 內(nèi)全部死亡。剖檢小鼠組織病變表現(xiàn)為肝臟腫脹、邊緣淤血，脾臟腫大，肺臟充血水腫，對(duì)照組無發(fā)病或死亡。剖檢后取內(nèi)臟器官按前述方法進(jìn)行細(xì)菌分離，并通過生化試驗(yàn)和16S rRNA PCR 法鑒定,結(jié)果與豬肺臟中分離到的Kpn 一致。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2，分離株對(duì)慶大霉素、丁胺卡那和頭孢唑肟高度敏感，而對(duì)頭孢哌酮、哌拉西林、阿莫西林+克拉維酸、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等19 種常用藥物耐受，表明該分離菌株為多重耐藥菌株。

3 討論

本研究分離得到的Kpn 菌株在血平板上呈現(xiàn)α溶血現(xiàn)象，而以往分離的Kpn 尚無溶血活性的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)分離的Kpn 菌株這一特性可能與其對(duì)小鼠具有較強(qiáng)致病性相關(guān)。經(jīng)分析有3 種可能性：第一種可能性是該菌發(fā)生基因突變，使得有關(guān)溶血方面的基因得到表達(dá)；第二種可能性是溶血素基因的水平轉(zhuǎn)移，并在Kpn 中得到表達(dá)，因有報(bào)道表明α溶血素分泌系統(tǒng)基因在革蘭氏陰性桿菌間存在基因傳遞潛能[10-11]；第三種可能性是該菌分泌的代謝產(chǎn)物使得血細(xì)胞破碎。其確切的溶血原因，還有待進(jìn)一步研究。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity tests results

在分離培養(yǎng)的過程中本研究發(fā)現(xiàn)該菌在麥康凱培養(yǎng)基上菌落顏色先紅色，后橙黃色，分析可能是因?yàn)樵摼x較快，先利用乳糖為碳源產(chǎn)生酸性物質(zhì)，當(dāng)乳糖被消耗完后，該菌又利用這些酸性產(chǎn)物作為碳源，并且該菌通過脫羧作用等分泌一些堿性物質(zhì)，從而使培養(yǎng)基pH 值由酸性變?yōu)閴A性，所以眼觀菌落表現(xiàn)為由紅色變?yōu)槌赛S色。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株對(duì)氨基糖苷類抗生素敏感，利用慶大霉素等藥物對(duì)發(fā)病豬場進(jìn)行防治后，疫情得到了控制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其對(duì)青霉素類、青霉素類與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制、部分頭孢類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類等抗生素耐藥，該菌具有多重耐藥性。該菌株對(duì)青霉素類及青霉素類與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑不敏感，且對(duì)部分頭孢類抗生素低程度耐藥，提示其可能含有耐酶抑制劑β-內(nèi)酰胺酶[12-13]。同時(shí)該菌對(duì)供試的喹諾酮類抗生素耐藥，提示其gyrA 和parC 基因可能已經(jīng)發(fā)生變異[14]。

本研究從豬肺臟分離得到的Kpn 菌株不僅在培養(yǎng)特性上發(fā)生改變，而且具有較強(qiáng)的致病性及多重耐藥性，以上結(jié)果為Kpn 耐藥機(jī)制和致病機(jī)理的相關(guān)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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