多氯聯(lián)苯降解菌所產(chǎn)聯(lián)苯雙加氧酶的酶學(xué)性質(zhì)

趙 翔， 方 麗， 彭書傳， 吳 克

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系，安徽 合肥 230601）

0 引 言

多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，簡稱PCBs）是德國科學(xué)家H·施米特和G·舒爾茨于1881年首次在實驗室以聯(lián)苯為原料在金屬催化劑的作用下高溫氯化生成的一類物質(zhì)［1］，其性質(zhì)與DDT類似，分子式為（C12H10）nCln。PCBs具有持久性，一旦排放到環(huán)境中就很難被降解和分解［2］；還有生物蓄積性［3］、揮發(fā)性與遠距離遷移性［4］以及高毒性［5］。人們開始研究怎樣檢測、分離和降解PCBs［6］。

多氯聯(lián)苯好氧降解包括上下游2步［7］：上游途徑中PCBs氧化開環(huán)轉(zhuǎn)化為氯代苯甲酸和五碳烯酸；下游途徑中氯代苯甲酸繼續(xù)降解，最后進入三羧酸循環(huán)。微生物對多氯聯(lián)苯的降解，主要是通過其所產(chǎn)酶的催化氧化起作用，其中聯(lián)苯雙加氧酶在降解過程中起了主要作用［8］。這種酶通過催化氧原子在聯(lián)苯苯環(huán)上發(fā)生反應(yīng)生成兒茶酚，然后導(dǎo)致苯環(huán)發(fā)生開環(huán)反應(yīng)。

本文以課題組保藏菌種多氯聯(lián)苯降解菌枯草桿菌WF1為研究對象，對其生成的聯(lián)苯雙加氧酶進行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，主要包括聯(lián)苯雙加氧酶在細胞中的定位，溫度、pH值、種齡及金屬離子對酶活力的影響，以及其酶解反應(yīng)動力學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 微生物及其培養(yǎng)基

微生物：多氯聯(lián)苯降解菌為本課題組保藏菌種，命名為枯草桿菌WF1。

無 機 鹽 培 養(yǎng) 基：KH2PO40.5g／L、K2HPO40.5g／L、MgSO40.2g／L、CaCl20.1g／L、NaCl 0.2g／L、（NH4）2SO41.0g／L，聯(lián)苯0.5g／L，pH值為7.0。固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

降 解 培 養(yǎng) 基：KH2PO40.5g／L、K2HPO40.5g／L、MgSO40.2g／L、CaCl20.1g／L、NaCl 0.2g／L、（NH4）2SO41.0g／L，2，3′，4′，5－四氯聯(lián)苯－正己烷溶液0.5mg／L，pH 值為7.0。

培養(yǎng)基（不加聯(lián)苯）均在121℃、0.1MPa下滅菌20min后使用，聯(lián)苯經(jīng)過紫外滅菌后再加入到培養(yǎng)基中。

1.2 分析方法

蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍G－250法［9］。

酶活分析方法的建立：多氯聯(lián)苯的降解是由聯(lián)苯雙加氧酶主導(dǎo)的，2，3－二羥基聯(lián)苯雙加氧酶催化2，3－二羥基聯(lián)苯生成2－羥基－6－氧－6－苯基－2，4－二烯酸（HOPDA）的過程，此物質(zhì)在434nm處有最大吸收。因此，用紫外－可見分光光度計測定反應(yīng)體系中產(chǎn)物在434nm處的吸光值，以此來測定酶活力。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗酶液的制備方法

將菌體在無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)后投入到降解培養(yǎng)基中，以35℃、150r／min培養(yǎng)48h后，于4℃、11 000r／min離心10min，收集上清液得到胞外粗酶液。菌體用磷酸緩沖液（25mmol／L，pH＝7.4）震蕩清洗2次后懸浮，在冰浴中用超聲波細胞破碎儀破碎細胞30min，最后于4℃、22 000r／min離心20min，收集上清液，即得到胞內(nèi)粗酶液［10－15］。

1.3.2 PCBs降解酶在細胞中的定位

分別檢測菌株發(fā)酵培養(yǎng)基上清液和菌體中的PCBs降解酶活性，以確定菌株P(guān)CBs降解酶屬于胞內(nèi)酶還是胞外酶。

1.3.3 PCBs降解酶酶活力影響因素

分別研究環(huán)境溫度、pH值、種齡及重金屬離子對酶活力大小的影響，以確定酶促反應(yīng)的最適條件。

（1）溫度對酶活的影響。分別在15、25、35、45、55、65℃下發(fā)酵培養(yǎng)2d，并在25、30、35℃下分別保溫1h，在35℃水浴中測定酶活，以35℃培養(yǎng)2d保溫0h的酶活為基準（100%）。

（2）pH值對酶活力的影響。分別在pH值為 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 下 于35℃水浴中保溫0、1、2h，測定酶活，以在pH＝7.5下保溫0h的酶活作為基準（100%）。

（3）種齡對酶活的影響。分別將種齡為12、24、36、48、60、72h的種子培養(yǎng)液接種進液體降解培養(yǎng)基中，測定PCBs降解酶的酶活，以種齡為72h的降解培養(yǎng)液的酶活作為基準（100%）。

（4）金屬離子對酶活的影響。在液體降解培養(yǎng)基中分別加入相同質(zhì)量濃度的 Na＋、K＋、Fe2＋、Mg2＋、Cu2＋和 Ca2＋，在相同條件下以不含以上金屬離子的培養(yǎng)基作對照，搖瓶發(fā)酵72h，測定酶活。

（5）PCBs降解酶的動力學(xué)研究。酶液量對反應(yīng)速度的影響：分別移取5份2mL PCBs溶液在35℃水浴中保溫5min，各加入粗酶2、4、6、8、10mL，計時2min，然后加入NaOH溶液終止反應(yīng)。底物濃度對反應(yīng)速度的影響：分別加入2、4、6、8、10mLPCBs溶液于35℃水浴中保溫5min，加入粗酶液2mL，計時2min，然后加入NaOH溶液終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCBs降解酶在細胞中的定位

檢測PCBs降解酶在菌株WF1降解培養(yǎng)基上清液和菌體內(nèi)的活性，結(jié)果得到胞外提取液的相對酶活為17%，而胞內(nèi)提取液的相對酶活為82%。菌株WF1的液體降解培養(yǎng)基中上清液部分幾乎檢測不出活性，而菌體能檢測出較高的酶活，由此推斷菌體產(chǎn)生的降解PCBs的代謝酶屬于胞內(nèi)酶。

2.2 溫度對酶活力的影響

不同溫度對產(chǎn)PCBs降解酶的酶活及PCBs降解酶在不同溫度條件下的穩(wěn)定性如圖1所示。結(jié)果表明，菌株WF1所產(chǎn)PCBs降解酶的最適溫度在25～45℃，35℃時為最高，25、35、45℃下發(fā)酵液中提取的粗酶液在25、30、35℃中保溫1h后的相對酶活都在50%左右。65℃條件下培養(yǎng)所產(chǎn)的PCBs降解酶相對酶活力均在20%以下，在30℃保溫1h后相對酶活只有11%。

圖1 溫度對酶活力及其穩(wěn)定性的影響

2.3 pH值對酶活力的影響

酵體系中的pH值過低或過高對酶的催化都有不利影響，甚至使酶失活［16］。pH值對酶活力及其穩(wěn)定性的影響如圖2所示，菌株WF1的最適產(chǎn)PCBs降解酶pH值在6.5～8.0左右，且在弱堿性環(huán)境下的相對酶活力比弱酸性環(huán)境要高。菌株WF1產(chǎn)酶的pH值穩(wěn)定性也相對較好，在pH值為7.0～8.0范圍內(nèi)保溫1h后能保持79%以上的活力，2h后仍能保持76%的活力，而pH值在小于6.5和大于8.0時酶活下降速度較快。

因此，可以通過緩沖溶液或者改變培養(yǎng)基的成分與比例等方法，對培養(yǎng)基的pH值進行適當?shù)恼{(diào)節(jié)和控制，以滿足細胞生長和產(chǎn)酶的需求。

圖2 pH值對酶活力及其穩(wěn)定性的影響

2.4 種齡對酶活力的影響

種齡對酶活力的影響如圖3所示，當菌體WF1種子培養(yǎng)72h后接入降解培養(yǎng)基，所獲得的酶活相對較高。種齡的優(yōu)化有利于掌握最佳發(fā)酵時間。種齡，指種子的生長年齡。種齡太短，用來接種發(fā)酵時，種子還處在延滯期或剛進入對數(shù)期，會導(dǎo)致前期菌體生長緩慢，發(fā)酵周期延長，甚至?xí)斐僧惓０l(fā)酵［17］。種齡太長，種子處在穩(wěn)定期后期或衰亡期，接種后也會導(dǎo)致子代培養(yǎng)物的延滯期增長，因此選擇合適的種齡進行接種就顯得極為重要。一般選擇對數(shù)生長期的后期或剛剛進入穩(wěn)定期的菌體作為種子，此時整個群體的生理特性較為一致，菌體生長極為旺盛，細胞各成分平衡增長，可以很快適應(yīng)新的環(huán)境，而且可以最大限度地提高細胞的干質(zhì)量［18］。

圖3 種齡對酶活力的影響

2.5 金屬離子對酶活力的影響

金屬離子是微生物生長代謝過程中非常重要的一類營養(yǎng)物質(zhì)，它們在有機體內(nèi)的生理作用很多，如參與酶的組成、構(gòu)成酶的最大活性、調(diào)節(jié)與維持細胞的滲透壓平衡、維持細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，控制細胞的氧化還原電位等［19－22］。不同金屬離子對酶活力的影響不同，它們對酶的結(jié)構(gòu)和功能所起的作用也不相同。具體情況見表1所列。Na＋能顯著提高酶活，K＋基本沒有影響，Mg2＋、Ca2＋、Fe2＋和Cu2＋則均有不同程度的抑制作用。

表1 金屬離子對酶活力的影響

2.6 PCBs降解酶的動力學(xué)研究

2.6.1 酶液量對反應(yīng)速度的影響

PCBs初始質(zhì)量濃度為0.218mg／L，不同的酶液量對反應(yīng)速度rp的影響見表2所列。rp＝（ρ0－ρ反應(yīng)后）／t。其中，ρ0為初始 PCBs質(zhì)量濃度；ρ反應(yīng)后為反應(yīng)后PCBs質(zhì)量濃度；t為反應(yīng)時間。

以反應(yīng)速度rp對酶液量做圖以了解PCBs降解酶酶液量的影響。所得擬合方程為：

隨著酶量的增加，反應(yīng)速率成線性增加，表明聯(lián)苯雙加氧酶降解PCBs的反應(yīng)速率與酶的質(zhì)量濃度呈一級關(guān)系。

表2 酶液量對反應(yīng)速度rp的影響

2.6.2 底物質(zhì)量濃度對反應(yīng)速度的影響

以PCBs作為唯一底物時其質(zhì)量濃度變化對反應(yīng)速率rp的影響見表3所列，做圖如圖4所示。

表3 底物質(zhì)量濃度對反應(yīng)速度rp的影響

圖4 底物質(zhì)量濃度對反應(yīng)速度rp的影響

由圖4可以看出，以PCBs為唯一底物時，在酶濃度不變的情況下，酶促反應(yīng)速度與底物質(zhì)量濃度呈典型的雙曲線關(guān)系。因此，可以用米氏（Michaelis－Menten）方程來模擬聯(lián)苯雙加氧酶降解PCBs的酶促反應(yīng)過程。建立模型如下：

其中，rmax為酶濃度不變的情況下，酶被底物飽和所達到的最大反應(yīng)速度；Km為米氏常數(shù)，當反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度1／2時所對應(yīng)的底物質(zhì)量濃度；S為底物質(zhì)量濃度。

根據(jù)（1）式可得rmax＝2.04mg／（L·min），Km＝8.32mg／L。

3 結(jié) 論

（1）本實驗在多氯聯(lián)苯降解菌菌株 WF1中檢測到聯(lián)苯雙加氧酶的活性，所產(chǎn)降解酶為胞內(nèi)酶，確定其適宜反應(yīng)溫度為35℃，適宜pH值為7.5，且 Na＋能提高酶活，K＋基本沒有影響，Mg2＋、Ca2＋、Fe2＋和Cu2＋則均有不同程度的抑制作用。

（2）對聯(lián)苯雙加氧酶降解多氯聯(lián)苯的酶反應(yīng)動力學(xué)研究表明，可以通過米氏方程＋（Km／rmax）S－1為“模型”，確定其動力學(xué)特征參數(shù)，rmax和Km分別為2.04mg／（L·min）和8.32mg／L。

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