東北白鵝CD8α基因的克隆及其胞外區(qū)基因的表達(dá)與抗血清的制備

張雪蓮，魏雙施，劉曉玫，邵建偉，張樹棟，李珊珊，高明春，張文龍，邢育鋼，馬 波＊，王君偉＊

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱150001；3.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

CD8分子是一種重要的T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志，CD8＋T淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原刺激最終分化為殺傷性T細(xì)胞（CTL）。CD8分子在MHCⅠ限制性T淋巴細(xì)胞上表達(dá)，具有高度T細(xì)胞特異性，它能以同源二聚體（αα）或者異源二聚體（αβ）形式存在［1］。CD8分子作為TCR的輔助受體參與對(duì)MHCⅠ分子遞呈抗原的識(shí)別。CD8分子與MHCⅠ分子的相互作用能加強(qiáng)MHCⅠ分子和TCR之間結(jié)合的親和力。

1997年，M.Luhtala等［2］克隆得到雞CD8α基因序列，其開放閱讀框?yàn)?08 bp，編碼235個(gè)氨基酸。與人和小鼠的CD8α基因序列的相似性分別是31%和29%。2005年，S.Kothlow等［3］克隆獲得鴨CD4、CD8α和CD3ε分子。鴨CD8α基因序列的開放閱讀框?yàn)?14 bp，編碼237個(gè)氨基酸，含有23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成熟蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量約為24.1 ku。鴨CD8α蛋白序列與雞CD8α的相似性為59.6%，與人CD8α的相似性為25.1%。2013年，Q.Zhao等［4］克隆得到四川白鵝CD8α（KC476104）基因，全長(zhǎng)為1 459 bp，包含1個(gè)711 bp的完整開放閱讀框，共編碼236個(gè)氨基酸，通過(guò)半定量RTPCR的方法分析了CD8αmRNA在幼鵝和成鵝體內(nèi)各組織器官中的轉(zhuǎn)錄水平。

本研究首次克隆東北白鵝CD8α基因，并利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了其胞外區(qū)基因編碼產(chǎn)物，制備了抗血清，為建立一種檢測(cè)鵝外周血CD8＋T淋巴細(xì)胞方法提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及主要試劑 E.Z.N.A.?HP總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA Bio-tek生物技術(shù)有限公司；SMART反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Clontech寶生物工程有限公司；Prime STAR DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker及蛋白質(zhì)Marker等購(gòu)自Ta KaRa寶生物工程有限公司；原核表達(dá)載體p ET-28a（＋）、p ET-30a（＋）購(gòu)自Novagen公司；RosettaTM（DE3）p LysS由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）、FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體以及DAPI購(gòu)自博奧森公司；Lipofectamine?LTX轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。東北白鵝購(gòu)自黑龍江省哈爾濱市平山養(yǎng)鵝場(chǎng)；新西蘭兔購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank發(fā)表的綠頭鴨CD8α（AF378373）基因序列設(shè)計(jì)引物獲得東北白鵝CD8α基因。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)CD8α胞外區(qū)的原核表達(dá)引物及真核表達(dá)引物，以上引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 東北白鵝CD8α基因的克隆與鑒定 取50 mg東北白鵝胸腺組織加液氮研磨成粉末后，按照E.Z.N.A.HP總RNA提取試劑盒說(shuō)明書的方法提取總RNA并測(cè)定濃度和純度。按SMART反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板分別用表1中的引物和Prime STAR DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50μL。反應(yīng)條件：98℃3 min；98℃30 s、57℃30 s、72℃2 min，15個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。將純化后的PCR產(chǎn)物與p EASYBlunt載體連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，陽(yáng)性者送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序并命名為p EASYBlunt-CD8α，測(cè)序后的序列利用DNAMAN生物軟件及在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)分析［5-6］。

1.2.2 東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 以p EASY-Blunt-CD8α質(zhì)粒為模板，利用表1中的表達(dá)引物克隆原核表達(dá)和真核瞬時(shí)表達(dá)的東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因，純化的PCR產(chǎn)物連接入p EASY-Blunt Simple載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TG1，提取質(zhì)粒酶切鑒定，將鑒定為陽(yáng)性的單克隆菌液送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

表1 東北白鵝CD8α基因的克隆引物及其胞外區(qū)表達(dá)引物序列Table 1 Primers sequence for Northeast White Goose CD8αgene clone and extracellular region expression

重組陽(yáng)性質(zhì)粒p EASY-Blunt-Simple-CD8αex、p ET-30a（＋）和p ET-28a（＋）分別用KpnⅠ和Hin dⅢ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因與載體片段并連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TG1，提取質(zhì)粒酶切鑒定，構(gòu)建CD8α胞外區(qū)基因原核表達(dá)載體p ET-30a-CD8αex以及p ET-28a-CD8αex，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞RosettaTM（DE3）p LysS。以同樣的方法構(gòu)建CD8α胞外區(qū)基因真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CD8αex。

1.2.3 東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因的表達(dá)及純化按文獻(xiàn)方法進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)［7］。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)。SDS-PAGE分析顯示重組蛋白質(zhì)以包涵體表達(dá)為主，收集到的菌體超聲破碎后，12 000 r·min-1離心15 min，沉淀用8 mol·L-1尿素溶解。

根據(jù)重組蛋白的表達(dá)形式采取變性條件下純化目的蛋白［8］，采用PBS-甘油透析液4℃透析，每隔4～6 h換次液，除去尿素，12%SDS-PAGE分析純化效果。利用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定純化后蛋白濃度，純化產(chǎn)物加入20%甘油，分裝保存于-20℃。

1.2.4 抗血清的制備與鑒定

1.2.4.1 抗血清的制備：將純化的目的蛋白以0.1 mg·只-1的劑量免疫新西蘭兔，首次免疫時(shí)將蛋白質(zhì)溶液與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化至油包水的程度，背部皮下多點(diǎn)注射新西蘭兔，此后與等量的弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，免疫方法同前。每2周免疫一次，并在免疫后7～10 d耳緣靜脈采血檢測(cè)抗體的ELISA效價(jià)，共免疫4次，加強(qiáng)免疫一周后心臟采血，分離血清并保存［8］。

1.2.4.2 I-ELISA方法測(cè)定抗血清的效價(jià)：以純化后的重組蛋白質(zhì)200 ng·孔-1包被ELISA微量反應(yīng)板，4℃包被過(guò)夜，0.5%Tween-PBS洗滌3次，5%脫脂乳37℃封閉2 h，洗滌后，加入倍比稀釋的抗血清，同時(shí)用免疫前兔血清作為陰性對(duì)照。二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋。TMB顯色，1 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm的吸光度。

1.2.4.3 抗血清的Western blot分析：將純化后重組蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）上，以制備的抗血清為一抗（1∶400稀釋），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG為二抗（1∶2 000），4-CN顯色［7］，并以p ET-28a（＋）空載體做陰性對(duì)照。

1.2.4.4 抗血清的純化：將制備的抗血清利用不同濃度的飽和硫酸銨進(jìn)行粗純，再按照GenScript公司Protein G抗體純化試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行純化［9］。純化分離得到的抗血清，用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定純化出的抗體濃度，SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 抗血清反應(yīng)性的鑒定

1.2.5.1 全細(xì)胞I-ELISA檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性：按參考文獻(xiàn)［10］過(guò)尼龍棉柱分離東北白鵝外周血T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，1×105·孔-1包被ELISA微量反應(yīng)板，37℃包被16～24 h，0.5%Tween-PBS洗滌3次，5%脫脂乳37℃封閉2 h，洗滌后，加入倍比稀釋的抗血清，同時(shí)用免疫前兔血清作陰性對(duì)照。二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，1∶5 000稀釋。TMB顯色后1 mol·L-1H2SO4終止，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm的吸光度，以抗血清OD450nm接近于1，P／N≥2的血清稀釋度為最佳稀釋度。

1.2.5.2 間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性：常規(guī)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑LTX說(shuō)明書將pcDNA3.1-CD8αex轉(zhuǎn)染CEF。轉(zhuǎn)染后48 h，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3次；適量4%的多聚甲醛4℃固定30 min；PBS洗3次；加入上述純化的抗血清，經(jīng)1∶100倍稀釋后，37℃作用1 h；PBS洗3次；加入工作濃度FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體為二抗，37℃避光作用1 h，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)產(chǎn)生情況。并設(shè)pcDNA3.1（＋）空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染孔作為陰性對(duì)照。

1.2.5.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性：常規(guī)方法制備鵝外周血淋巴細(xì)胞（GoPBLs），收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到1×106·m L-1，將細(xì)胞分裝于瓶皿中，利用4%的多聚甲醛固定過(guò)夜，分散均勻，利用0.5%Triton-X-100處理細(xì)胞20 min，PBS洗滌2～3次后，加入抗血清作為一抗，經(jīng)PBA（含1%BSA的PBS緩沖液）100倍稀釋，37℃孵育30 min，PBS洗2～3次，加入工作濃度下的FITC標(biāo)記的羊抗兔Ig G抗體為二抗，37℃避光孵育45 min，PBS洗2～3次后，利用0.5 mg·m L-1的DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，37℃作用30 min，PBS洗2～3次，激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)的產(chǎn)生情況。

2 結(jié) 果

2.1 東北白鵝CD8α基因的克隆

PCR擴(kuò)增得到東北白鵝CD8α基因，擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳顯示的條帶大小為900 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，具體結(jié)果如圖1A所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到p EASY-Blunt載體上，重組質(zhì)粒p EASY-Blunt-CD8α經(jīng)Bam HⅠ酶切，獲得了4.8 kb的片段；經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切得到約3.9和0.9 kb兩條片段；如圖1B所示，證實(shí)外源基因成功連接到p EASY-Blunt載體上。東北白鵝CD8α基因的核苷酸序列與綠頭鴨CD8α（AF378373）及四川白鵝CD8α（KC476104）的相似性分別為89%和99%，Blast結(jié)果顯示目的基因?yàn)镃D8α同源物，可以確定目的基因?yàn)闁|北白鵝CD8α的基因序列，將序列提交至NCBI獲得登錄號(hào)JQ272859。

圖1 東北白鵝CD8α基因的克?。ˋ）及鑒定（B）Fig.1 Cloning（A）and identification（B）of Northeast White Goose CD8αgene

2.2 東北白鵝CD8α胞外區(qū)原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用表1中所列的CD8α胞外區(qū)原核表達(dá)引物，PCR擴(kuò)增得到東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳顯示的條帶大小為552 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，如圖2A所示。將純化的PCR產(chǎn)物連接到p ET-30a載體上，重組質(zhì)粒經(jīng)Hin dⅢ單酶切、KpnⅠ與Hin dⅢ雙酶切后得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符；證實(shí)外源基因成功連接到載體p ET-30a（＋）上，如圖2B所示。將純化的PCR產(chǎn)物連接到p ET-28a載體上，以重組質(zhì)粒p ET-28a-CD8αex為模板，經(jīng)PCR后，得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，證實(shí)外源基因成功連入p ET-28a（＋）上，如圖2C所示。

圖2 用于原核表達(dá)的東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因的克隆、重組原核表達(dá)載體的鑒定Fig.2 Cloning of Northeast White Goose CD8αextracellular region gene used to prokaryotic express and identification of recombinant prokaryotic expression vector

2.3 東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用表1中所列的CD8α胞外區(qū)真核表達(dá)引物，PCR擴(kuò)增獲得CD8α胞外區(qū)基因（含有Kozak序列），擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳顯示的條帶大小為558 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，如圖3A所示。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pcDNA3.1（＋）載體上，經(jīng)Hin dⅢ單酶切、Hin dⅢ與XhoⅠ雙酶切后得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符；證實(shí)外源基因成功連接到pcDNA3.1（＋）載體上，如圖3B所示。

2.4 東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

含有重組表達(dá)載體p ET-30a-CD8αex、p ET-28a-CD8αex以及空載體p ET-30a（＋）、p ET-28a（＋）的Rosetta菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，通過(guò)SDSPAGE分析，在30、25 ku處分別顯現(xiàn)出特異性的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)計(jì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小相符，利用Ni-NTA柱親和層析純化重組蛋白質(zhì)，結(jié)果見圖4和圖5所示。

2.5 抗血清的鑒定與純化

2.5.1 I-ELISA方法測(cè)定抗血清效價(jià) 經(jīng)間接ELISA測(cè)定，制備的抗血清效價(jià)為1∶12 800。

圖3 用于真核表達(dá)的東北白鵝CD8α胞外區(qū)基因的克?。ˋ）及重組真核表達(dá)載體的鑒定（B）Fig.3 Cloning（A）of Northeast White Goose CD8αextracellular region gene used to eukaryotic expression and identification（B）of recombinant eukaryotic expression vector

2.5.2 抗血清的Western blot鑒定 純化的重組蛋白質(zhì)（p ET-28a-CD8αex）經(jīng)過(guò)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western blot分析。以制備的抗血清作為第一抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG酶標(biāo)抗體作為第二抗體進(jìn)行檢測(cè)，重組蛋白質(zhì)均出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，條帶大小均與預(yù)期一致，見圖6。

圖4 原核表達(dá)東北白鵝CD8α胞外區(qū)重組蛋白質(zhì)（pET-30a-CD8αex）的SDS-PAGE分析及其純化Fig.4 SDS-PAGE analysis and purification of prokaryotic expressed CD8αextracellular region（pET-30a-CD8αex）of Northeast White Goose

圖5 原核表達(dá)東北白鵝CD8α胞外區(qū)重組蛋白質(zhì)（pET-28a-CD8αex）的SDS-PAGE分析及其純化結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE analysis and purification of prokaryotic expressed CD8αextracellular region（pET-28a-CD8αex）of Northeast White Goose

2.5.3 抗血清的純化 利用Protein G可與抗體Fc段發(fā)生特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將制備的兔抗鵝CD8α胞外區(qū)抗血清進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果明顯顯示出2條目的蛋白質(zhì)條帶，一條為重鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為52 ku左右，另一條為輕鏈，相對(duì)分子質(zhì)量約為25 ku左右，純化結(jié)果如圖7所示。

圖6 東北白鵝CD8α胞外區(qū)重組蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of recombinant protein CD8α extracellular region of Northeast White Goose

圖7 兔抗東北白鵝CD8α胞外區(qū)抗血清的純化Fig.7 Purification of rabbit anti-CD8αextracellular region of Northeast White Goose antiserum

2.5.4 抗血清的反應(yīng)性鑒定

2.5.4.1 全細(xì)胞I-ELISA檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性：全細(xì)胞I-ELISA檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性，結(jié)果如圖8所示。純化后的抗血清可與外周血T淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，且最佳的血清稀釋度為1∶800。

2.5.4.2 間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性：將構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CD8αex和空載體質(zhì)粒pc DNA3.1（＋）分別轉(zhuǎn)染CEF后，收獲轉(zhuǎn)染的CEF用于熒光信號(hào)的檢測(cè)。如圖9顯示，抗血清能特異性識(shí)別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CD8αex的CEF，且檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而空載體質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則無(wú)熒光信號(hào)，表明制備的抗血清與CEF瞬時(shí)表達(dá)的CD8α胞外區(qū)蛋白質(zhì)發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。

圖8 全細(xì)胞I-ELISA檢測(cè)兔抗東北白鵝CD8α胞外區(qū)抗血清的反應(yīng)性Fig.8 Reactivity identification of rabbit anti-CD8αextracellular region of Northeast White Goose antiserum by the whole cells I-ELISA

2.5.4.3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)抗血清的反應(yīng)性：利用熒光標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡相結(jié)合的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組鵝外周血淋巴細(xì)胞（GoPBLs）在只添加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和DAPI染色結(jié)果疊加下未見特異性綠色熒光，僅有藍(lán)色熒光；試驗(yàn)組以制備的抗血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗和DAPI染色結(jié)果疊加發(fā)現(xiàn)顯著的綠色熒光集中在細(xì)胞膜上，細(xì)胞輪廓清晰如圖10所示。

圖9 兔抗東北白鵝CD8α胞外區(qū)抗血清的間接免疫熒光鑒定（200×）Fig.9 Identification of rabbit anti-CD8αextracellular region of Northeast White Goose antiserum by immuofluorescence（200×）

3 討 論

圖10 激光共聚焦法檢測(cè)鵝CD8＋T淋巴細(xì)胞（400×）Fig.10 Confocal scanning microscopy detects goose CD8＋T lymphocytes（400×）

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，根據(jù)其表面分化抗原的不同，可將T細(xì)胞分成若干亞群，其中具有CD8抗原的T細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc細(xì)胞），又稱為殺傷性T細(xì)胞（CTL細(xì)胞），是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞之一。Tc細(xì)胞可分泌細(xì)胞毒素-穿孔素（perforin）和顆粒酶（granzyme），導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生溶解，并可產(chǎn)生細(xì)胞因子——TNF-β和IFN-γ，其中TNF-β可與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞自殺［11］。因此檢測(cè)機(jī)體CD8＋T淋巴細(xì)胞并結(jié)合細(xì)胞因子水平可評(píng)價(jià)機(jī)體Tc細(xì)胞免疫的狀態(tài)［11-14］，為闡明機(jī)體抗感染和抗腫瘤的機(jī)制提供理論依據(jù)。

2005年，S.Kothlow等對(duì)北京鴨CD8α分子進(jìn)行真核表達(dá)，制備了相應(yīng)的單克隆抗體，對(duì)鴨的脾、胸腺、法氏囊及外周血液中淋巴細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定［15］。2008年，欒維民等利用小鼠抗雞CD3、CD4、CD8等單克隆抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法對(duì)雞外周免疫器官中淋巴細(xì)胞及其亞群的發(fā)育進(jìn)行了系統(tǒng)研究［16］。2011年，王燕等取發(fā)育到第14天的鵝胚胎到1日齡雛鵝的脾以小鼠抗人CD8單克隆抗體為第一抗體用免疫熒光雙標(biāo)法研究雛鵝CD8抗原的表達(dá)，并利用Hoeschst33342的熒光染色方法分析細(xì)胞凋亡率，探索鵝胚脾淋巴細(xì)胞選擇機(jī)制［17］。Q.Zhao等［4］克隆得到四川白鵝CD8α（KC476104）基因全長(zhǎng)為1 459 bp，包含一個(gè)711 bp的完整開放閱讀框，共編碼236個(gè)氨基酸，通過(guò)半定量RT-PCR的方法分析了CD8αmRNA在幼鵝和成鵝體內(nèi)各組織器官中的轉(zhuǎn)錄水平。目前針對(duì)鵝CD8＋T淋巴細(xì)胞特異性檢測(cè)試劑尚未見報(bào)道，這制約了有關(guān)鵝基礎(chǔ)免疫及免疫機(jī)制等方面的研究。

本研究克隆得到東北白鵝CD8α基因并通過(guò)生物學(xué)軟件分析比較了鵝和其他物種CD8α氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其胞外區(qū)親水性、抗原性較為明顯，說(shuō)明該基因的重要功能結(jié)構(gòu)域在胞外區(qū)，進(jìn)而利用原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得鵝CD8α胞外區(qū)蛋白質(zhì)。并以純化的重組蛋白質(zhì)為免疫原制備抗血清，利用重組蛋白質(zhì)為抗原的I-ELISA方法和全細(xì)胞I-ELISA方法測(cè)得制備抗血清效價(jià)分別為1∶12 800和1∶800，表明原核表達(dá)的重組蛋白質(zhì)具有良好的免疫原性，可在兔體內(nèi)產(chǎn)生較高滴度的抗體。經(jīng)全細(xì)胞I-ELISA及IFA，證明制備的抗血清特異性較高，能識(shí)別T細(xì)胞表面的CD8α分子和真核細(xì)胞表達(dá)的鵝CD8α胞外區(qū)蛋白質(zhì)。同時(shí)利用熒光標(biāo)記和激光共聚焦顯微鏡相結(jié)合的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到CD8＋T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜上出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，為研究在不同發(fā)育時(shí)期CD8＋T淋巴細(xì)胞在鵝體內(nèi)的發(fā)生、分布及分化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。該抗血清也可用于病原性感染或免疫抑制狀態(tài)下，鵝外周血中CD8＋T淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化的研究，為揭示機(jī)體的免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究為進(jìn)一步制備抗鵝CD8α分子的單克隆抗體奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)［18］。截至目前，本實(shí)驗(yàn)室已成功制備東北白鵝CD4［19］、CD8α分子的抗血清，為建立完善的檢測(cè)鵝T淋巴細(xì)胞亞群的技術(shù)平臺(tái)提供了物質(zhì)貯備。

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