膠體金法和質(zhì)譜法檢測(cè)禽蛋中喹諾酮類(lèi)殘留的比較

柳愛(ài)春，劉 超，趙 蕓，陳青舟，張宣偉

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024；2.杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310022）

膠體金法和質(zhì)譜法檢測(cè)禽蛋中喹諾酮類(lèi)殘留的比較

柳愛(ài)春1，劉 超1，趙 蕓1，陳青舟2，張宣偉2

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310024；2.杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310022）

分別采用多克隆抗體（多抗）和單克隆抗體（單抗）制備檢測(cè)喹諾酮類(lèi)藥物的免疫膠體金試劑盒檢測(cè)杭州地區(qū)市售禽蛋樣品128份，用多抗試劑盒檢出24份陽(yáng)性樣品（占總樣品量的18.8%），其中14份為強(qiáng)陽(yáng)性樣品（占總樣品量的10.9%）；用單抗試劑盒檢出42份陽(yáng)性樣品（占總樣品量的32.8%），其中24份為強(qiáng)陽(yáng)性樣品（占總樣品量的18.8%）。所有樣品再用液相?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS／MS）法檢測(cè)氟甲喹、諾氟沙星、依諾沙星等12種喹諾酮類(lèi)藥物殘留量，檢測(cè)結(jié)果為喹諾酮類(lèi)殘留總量＞100μg·kg－1的樣品14份、20～100μg·kg－1的樣品10份、2.0～20μg·kg－1的樣品16份、0.2～2.0μg·kg－1的樣品16份，2種不同的免疫膠體金試劑盒快速檢測(cè)結(jié)果與質(zhì)譜法的符合率分別為100%和95%。試驗(yàn)表明，膠體金法和質(zhì)譜法各有優(yōu)勢(shì)且結(jié)果符合性好。

喹諾酮類(lèi)藥物；禽蛋；膠體金法；快速檢測(cè)

喹諾酮類(lèi)（Quinolones，QNs）是一類(lèi)化學(xué)合成的抗菌藥，由于這類(lèi)藥物高效低毒、價(jià)格低廉，少量使用還有一定的促生長(zhǎng)作用，因此近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中預(yù)防、治療疾病。但是在長(zhǎng)期使用過(guò)程中，人們逐漸發(fā)現(xiàn)該類(lèi)藥物在動(dòng)物體內(nèi)消除緩慢，過(guò)量或不當(dāng)使用會(huì)造成動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留和蓄積。人體攝入后，除了可能會(huì)引起關(guān)節(jié)病變、消化道反應(yīng)、肝腎毒性、血液系統(tǒng)毒性等不良反應(yīng)外，長(zhǎng)期食用含低劑量抗生素，還導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥性［1］，甚至產(chǎn)生超級(jí)細(xì)菌［2］，從而不利于該類(lèi)藥物對(duì)人類(lèi)疾病的治療。在農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中，規(guī)定產(chǎn)蛋雞禁用恩諾沙星。到目前為止，雞蛋中藥物殘留的檢測(cè)方法報(bào)道較少，大多數(shù)是在動(dòng)物組織殘留檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)的，這也是雞蛋中獸藥殘留控制的一大問(wèn)題。因此，尋找高靈敏度、簡(jiǎn)單、快速、低成本的檢測(cè)方法是解決獸藥殘留的關(guān)鍵所在。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料

禽蛋樣品。購(gòu)自杭州市區(qū)多家超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的雞蛋114份、鴨蛋5份、鵪鶉蛋4份、鴿子蛋4份、鷓鴣蛋1份。

1.1.2 試劑

喹諾酮多克隆抗體免疫膠體金試劑盒（多抗試劑盒）和單克隆抗體免疫膠體金試劑盒（單抗試劑盒）系實(shí)驗(yàn)室自制，含免疫膠體金試劑板、復(fù)溶液和小滴管；12種氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氟甲喹Flumequine（簡(jiǎn)寫(xiě)Flu）、諾氟沙星Norfloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Nor）、依諾沙星Enoxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Eno）、環(huán)丙沙星Ciprofloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Cip）、培氟沙星Pefloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Pef）、洛美沙星Lomefloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Lom）、丹諾沙星（達(dá)氟沙星）Danofloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Dan）、恩諾沙星Enrofloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Enr）、氧氟沙星Ofloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Ofl）、麻保沙星Marbofloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Mar）、沙拉沙星Sarafloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Sar）、雙氟沙星Difloxacin（簡(jiǎn)寫(xiě)Dif）標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）；乙腈、甲醇、正己烷均為色譜純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Waters Xevo TQ?S液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)）；METTLER電子天平（上海）：感量0.01 g和0.0001 g；IKA磁力攪拌器和漩渦混勻器；KH3200DE超聲波儀（昆山）；Eppendorf 5810臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)）；N?EVAP氮吹儀（美國(guó)）；Thermo 10～100μL，100～1 000μL，1～5 mL移液器。

1.2 樣品制備

將剛采集的樣品編號(hào)加標(biāo)識(shí)后，每個(gè)樣品取1～3枚蛋，去殼后，將蛋黃和蛋清一起勻漿制成蛋液，并立即以多抗試劑盒用免疫膠體金法快速篩檢，蛋液留樣用5 m L冷凍管分裝，－20℃保存，以備膠體金法復(fù)檢和LC?MS／MS法定量檢測(cè)用；完整的禽蛋則根據(jù)膠體金法篩檢結(jié)果分成陽(yáng)性組和陰性組，于4～8℃冷藏保存。

1.3 多抗試劑盒免疫膠體金法快速篩檢

快速篩檢采用設(shè)計(jì)檢測(cè)限為20μg·kg－1多抗免疫膠體金試劑盒，用滴管吸取0.5 mL蛋液，加1 mL復(fù)溶劑，搖勻制成待檢溶液；從鋁箔袋中取出膠體金試劑板；用滴管吸取待檢溶液垂直滴加4滴（約125μL）于試劑板的加樣孔中；加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，在3～5 min內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果，結(jié)果判定原則參照文獻(xiàn)［3］。

1.4 單抗試劑盒免疫膠體金法復(fù)檢

復(fù)檢采用設(shè)計(jì)檢測(cè)限為2μg·kg－1單抗免疫膠體金試劑盒，實(shí)驗(yàn)方法基本參照1.3節(jié)稍加改動(dòng)，一是樣品稀釋倍數(shù)改為4倍，即吸取1 mL蛋液，加4 m L復(fù)溶劑，搖勻制成待檢溶液；二是顯色時(shí)間改為在5～8 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.5 用LC?MS／MS法檢測(cè)禽蛋中喹諾酮類(lèi)藥物

稱(chēng)取2.00 g樣品于15 mL試管中，加入4 mL酸化乙腈（2%甲酸）溶液，漩渦混勻，超聲3min，4 000 r·min－1離心5 min，取上清，沉淀用4 mL酸化乙腈重復(fù)提取一次，合并上清，定容至25 mL。提取液中加入10 m L乙腈飽和正己烷溶液，振蕩5 min，棄去上層正己烷，重復(fù)凈化一次。氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1 mL甲醇溶解，再加入1 mL水超聲30 s，過(guò)0.22μm濾膜，制成上機(jī)待測(cè)液。LC?MS／MS測(cè)定的儀器條件：流動(dòng)相A液為100%乙腈；B液為0.1%甲酸水溶，其他條件參照標(biāo)準(zhǔn)［4］，根據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片及其離子豐度比定性；外標(biāo)法定量，分別通過(guò)計(jì)算峰高和峰面積定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金法快速檢測(cè)結(jié)果

用多抗試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩檢，共檢出24份陽(yáng)性樣品（占總樣品量的18.8%），其中14份為強(qiáng)陽(yáng)性樣品（占總樣品量的10.9%）。用肉眼觀察試劑板T線和C線的顯色情況（圖1），1＃和2＃樣品T線比C線深或一樣深，視為陰性；3＃樣品T線比C線淺為陽(yáng)性；10＃、11?1＃和11?2＃樣品T線不顯色視為強(qiáng)陽(yáng)性。用單抗試劑盒對(duì)所有樣品進(jìn)行復(fù)檢，共檢出42份陽(yáng)性樣品（占總樣品量的32.8%），其中24份為強(qiáng)陽(yáng)性樣品（占總樣品量的18.8%）。

圖1 肉眼觀察試劑板T線和C線的顯色情況

2.2 LC?MS／MS法檢測(cè)結(jié)果

所有樣品再用液相?串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS／MS）法檢測(cè)氟甲喹、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、沙拉沙星、雙氟沙星等12種喹諾酮類(lèi)藥物殘留量，測(cè)得喹諾酮類(lèi)殘留總量＞100μg· kg－1（實(shí)測(cè)值為110～2 137μg·kg－1）的樣品14份，殘留總量在20～100μg·kg－1（實(shí)測(cè)值為24.3～86.6μg·kg－1）的樣品10份；殘留總量在2.0～20μg·kg－1（實(shí)測(cè)值為2.0～11.7μg· kg－1）的樣品16份；殘留總量為0.2～2.0μg· kg－1（實(shí)測(cè)值為0.23～1.98μg·kg－1）的樣品16份。不同污染程度樣品所占比例見(jiàn)圖2。

圖2 按喹諾酮?dú)埩艨偭坑?jì)不同污染程度樣品所占比例

所檢的12種喹諾酮類(lèi)藥物均有檢出，其中檢出率最高的是環(huán)丙沙星和氧氟沙星，各33份，其次為檢出恩諾沙星的樣品14份，諾氟沙星9份，依諾沙星8份，培氟沙星6份，氟甲喹和洛美沙星各3份，丹諾沙星、麻保沙星和雙氟沙星各2份，沙拉沙星1份。環(huán)丙沙星和氧氟沙星不僅檢出率高，殘留量也很高，環(huán)丙沙星殘留量大于100μg· kg－1的樣品有7份，其最高殘留量為715μg·kg－1；氧氟沙星殘留量大于100μg·kg－1的樣品有5份，其最高殘留量為601μg·kg－1（圖3），該樣品中還檢出麻保沙星留量為4μg·kg－1。培氟沙星的最高殘留量達(dá)2 026μg·kg－1，該樣品中還檢出諾氟沙星、依諾沙星和環(huán)丙沙星，總殘留量高達(dá)2 137μg·kg－1。

表1 LC?MS／MS法測(cè)得禽蛋中喹諾酮類(lèi)殘留總量

圖3 氧氟沙星殘留量最高的樣品質(zhì)譜圖

2.3 膠體金法和質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果比較

采用檢測(cè)限為20μg·kg－1的多抗免疫膠體金試劑盒共檢出24份陽(yáng)性樣品（其中強(qiáng)陽(yáng)性樣品14份），與質(zhì)譜法檢出喹諾酮總殘留量＞20μg·kg－1樣品合計(jì)24份（其中總殘留量＞100μg·kg－1的樣品14份），兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

采用檢測(cè)限為2μg·kg－1的單抗試劑盒檢出24份強(qiáng)陽(yáng)性樣品，與質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果完全相符。單抗免疫膠體金試劑盒共檢出42份陽(yáng)性樣品，與質(zhì)譜法檢出殘留總量＞2μg·kg－1的樣品共40份相比較，符合率為95%，其中2個(gè)不相符的樣品，質(zhì)譜法檢測(cè)殘留總量分別為1.98和1.30μg· kg－1，1.98μg·kg－1的樣品檢出為陽(yáng)性，認(rèn)為在判定誤差范圍允許之內(nèi)；殘留總量1.30μg·kg－1的樣品膠體金法檢出為陽(yáng)性，而其他殘留總量在1.44～1.94μg·kg－1均檢出為陰性，可能是因?yàn)槌吮敬螌?shí)驗(yàn)中質(zhì)譜所檢的12種之外，還存在其他種喹諾酮藥物殘留，根據(jù)抗體研制時(shí)的測(cè)試結(jié)果，該抗體可與15種以上的喹諾酮藥物發(fā)生反應(yīng)。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)以膠體金法和質(zhì)譜法檢測(cè)禽蛋中喹諾酮?dú)埩舻谋容^發(fā)現(xiàn)，這兩種方法檢測(cè)結(jié)果高度相符，且在禽蛋質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與控制中各有優(yōu)勢(shì)：膠體金法的主要優(yōu)點(diǎn)是快速、方便，適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，若參照農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中畜禽肉中100μg·kg－1的限量要求，無(wú)論是多抗試劑盒還是單抗試劑盒的檢測(cè)靈敏度均能完全滿足質(zhì)控要求；質(zhì)譜法的主要優(yōu)點(diǎn)是定性和定量準(zhǔn)確，因此，這兩種方法分別適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室確證及定量檢測(cè)。

盡管農(nóng)業(yè)部明令禁止在產(chǎn)蛋雞中使用喹諾酮類(lèi)藥物，在研究中也發(fā)現(xiàn)杭州市在售禽蛋中的喹諾酮類(lèi)殘留情況較為嚴(yán)重，與目前我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)不規(guī)范用藥和在飼料中添加抗生素有關(guān)，這種禁而不止的現(xiàn)象多年來(lái)屢見(jiàn)不鮮，因此現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法的研究對(duì)推進(jìn)市場(chǎng)準(zhǔn)入制度和產(chǎn)地準(zhǔn)出制度的實(shí)施具有比較現(xiàn)實(shí)的意義。

［1］ 李金梅，李雨珊，劉華，等.健康兒童腸道大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs菌株耐藥性研究［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2015，12（3）：210－211.

［2］ 張國(guó)成.重視兒童超級(jí)細(xì)菌感染的診斷與治療的研究［J］.發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志，2014，2（4）：193－197.

［3］ 柳愛(ài)春，劉超，趙蕓，等.免疫膠體金法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（1）：95－102.

［4］ GB／T 21312—2007動(dòng)物源性食品14種喹諾酮藥物殘留檢測(cè)方法液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

（責(zé)任編輯：盧福莊）

S 83；TS 207.5

A

0528?9017（2015）11?1763?03

文獻(xiàn)著錄格式：柳愛(ài)春，劉超，趙蕓，等.膠體金法和質(zhì)譜法檢測(cè)禽蛋中喹諾酮類(lèi)殘留的比較［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（11）：1763－1766.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151119

2015?09?14

杭州市社會(huì)發(fā)展科研專(zhuān)項(xiàng)（20130533B24）

柳愛(ài)春（1972－），女，浙江永康人，高級(jí)工程師，本科，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)和相關(guān)的科研工作。E?mail：liuaichun01＠163.com。