土壤水分對(duì)新鮮和采后干燥丹參根中活性成分含量的影響

王　微，周國軍，李　焱，周銅水

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院及天然藥物研究中心，上?！?00438)

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土壤水分對(duì)新鮮和采后干燥丹參根中活性成分含量的影響

王微，周國軍，李焱，周銅水

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院及天然藥物研究中心，上海200438)

摘要：目的進(jìn)一步驗(yàn)證丹參藥材中丹酚酸類成分尤其是丹酚酸B是采后干燥的產(chǎn)物；了解栽培過程中土壤水分狀態(tài)對(duì)新鮮和陰干后丹參藥材中丹酚酸類和丹參酮類成分的影響。方法采用高效液相色譜法測定了不同土壤水分條件栽培的新鮮和采后陰干丹參樣品中 6 種酚酸類和4種丹參酮類成分的含量。結(jié)果新鮮丹參樣品中，均含有較高含量丹參酮類成分，但只有極度干旱脅迫時(shí)(土壤水勢<30% )，才可檢測到丹酚酸B(<1%)，且無其他酚酸類成分。陰干樣品中丹酚酸類成分含量均顯著增加，其中丹酚酸B含量達(dá) 4.2%；丹參酮類成分也增加了 30%以上。陰干后丹參中丹酚酸B及總酚酸含量與栽培過程中土壤水勢呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論采后干燥有利于丹參中活性成分積累。丹參藥材中丹酚酸類成分尤其是丹酚酸B是栽培和采后極度干旱(干燥)的產(chǎn)物，栽培過程中適度的干旱脅迫有利于藥材中酚酸類成分的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：丹參；土壤水分；采后干燥；丹酚酸類和丹參酮類成分；HPLC

丹參(SlaviamiltiorrhizaBge)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，藥用干燥根莖。主要產(chǎn)于山東、安徽、河北和陜西等地。具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀止痛、養(yǎng)心除煩等功效，用于治療心血管疾病及糖尿病療效顯著[1-2]。丹參中活性成分主要分為兩類：以丹酚酸B為主的水溶性酚酸類成分，如原兒茶酸(PA)、原兒茶醛(PD)、丹參素(DSS)、咖啡酸(CA)、紫草酸(lLA)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸A(SaA)、丹酚酸B(SaB) 和丹酚酸C(SaC) 等；以丹參酮Ⅱa為主的脂溶性丹參酮類成分, 如隱丹參酮(cTN)、二氫丹參酮Ⅰ(dTNI)、丹參酮Ⅰ(TNI)、丹參酮Ⅱa(TNⅡa) 等[3-4]。中國藥典(2010 版)規(guī)定丹參藥材含水量應(yīng)低于13.0% ，丹酚酸B含量應(yīng)不低于3.0% ，丹參酮Ⅱa含量應(yīng)不低于0.2%[5]。

本實(shí)驗(yàn)室先前研究表明，丹參的主要水溶性活性成分丹酚酸B是采后干燥過程中產(chǎn)生的，而在新鮮的丹參中含量甚微(<0.1%)[6-8]。但是國內(nèi)的一些研究報(bào)道，丹酚酸B含量在“新鮮”丹參藥材中已達(dá)到較高水平(>3%)[9-10]。但這些報(bào)道均未對(duì)“新鮮”丹參樣品中的水分含量進(jìn)行測定。本實(shí)驗(yàn)采用不同土壤水分條件進(jìn)行丹參栽培，用 HPLC 方法測定了新鮮和陰干后丹參根中丹酚酸和丹參酮類成分含量變化的動(dòng)態(tài)，為進(jìn)一步證實(shí)我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供新的可靠證據(jù)。

1儀器與材料

Agilent 1100系列高效液相色譜儀；Kinetex C18100A色譜柱(美國Agilent公司)；水勢儀TEN-g45(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)。水為自制雙蒸水；色譜純乙腈購自德國Merck公司；其余均為分析純國產(chǎn)試劑。BP110S型電子天平(北京賽多利斯天平公司)。對(duì)照品DSS、RA、LA、SaA、SaB、SaC、dTNI、cTN、TNⅡa和TNI(上海友思生物科技有限公司)。一年生丹參幼苗于 2013 年 4 月 20 日購自山東臨朐縣。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1栽培試驗(yàn)方法將丹參幼苗植入高 20 cm、上口徑 21 cm、下口徑 12 cm的塑料盆，每盆 1 株，內(nèi)置約 1.8 kg的盆栽土(黑土、蛭石、珍珠巖，三者的體積比為 9 ∶3 ∶1)，放于溫室中進(jìn)行盆栽。于每日下午 5時(shí)定量補(bǔ)水 250 mL。盆栽至 8 月，從預(yù)栽的 300 盆中挑選出長勢優(yōu)良、大小基本一致的 150 盆進(jìn)行分組處理，平均分為高水分組、中水分組和低水分組。高水分組繼續(xù)于每日下午 5時(shí)定量補(bǔ)水 250 mL，中水分組每隔 3 d定量補(bǔ)水 250 mL，低水分組每隔 5 d定量補(bǔ)水 250 mL。高水分組土壤含水量維持在(95±2)%；中水分組土壤含水量維持在(74±3)%；低水分組土壤含水量維持在(64±4)%，分組培育 2 個(gè)月后，統(tǒng)一停止補(bǔ)水，進(jìn)行連續(xù)自然干旱，并分別于實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天和第 4、第 7、第 12天上午 9 時(shí)測量土壤水勢并進(jìn)行隨機(jī)取樣。新鮮丹參根樣品去除泥沙、洗凈，將一部分新鮮樣品經(jīng)液氮冷凍后粉碎，粉末于 -20℃保存待測；另一部分以整株?duì)顟B(tài)室內(nèi)陰干 20 d，陰干樣品粉碎后于-20℃保存待測。

2.2土壤水勢測定按土壤水勢測定儀說明書進(jìn)行測定。土壤水勢儀克力管中注滿水后，將土壤水勢儀陶瓷探頭插入土壤中，當(dāng)被測土壤的水勢與張力計(jì)存在壓力差時(shí)，張力計(jì)中的水滲入被測土壤直至達(dá)到平衡狀態(tài)，此時(shí)壓力表所顯示的值即為被測土壤的土壤水勢。

2.3丹參樣品水分含量測定實(shí)驗(yàn)參考《中國藥典》2010 版中烘干法進(jìn)行水分含量測定[7]，具體如下：將待測樣品置于干燥至恒重且精密稱重的培養(yǎng)皿，精密稱量初始重量，置于干燥器中，100～105℃干燥 5 h，冷卻 0.5 h后精密稱重，相同條件下，重復(fù)干燥、冷卻、稱重，直至前后兩次重量差異低于 5 mg，即恒重為止。根據(jù)損失的重量計(jì)算樣品的水分含量。每份樣品重復(fù) 3 次。

2.4化學(xué)成分含量測定化學(xué)成分含量測定方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[10]。各化合物的線性回歸方程分別為DSS：Y=6.41X + 1.38；RA：Y=3.62X + 4.35； LA：Y=3.85X + 4.42； SaA：Y=16.00X + 13.26；SaB：Y=4.70X + 8.70； SaC：Y=1.95X-1.65； dTNI：Y=27.94X + 35.00； cTN：Y=19.70X+88.18； TNI：Y=24.88X + 13.06； TNⅡa：Y=35.95X + 102.22。相關(guān)系數(shù)r值均大于 0.999，線性范圍(μg·g-1)依次為DSS：0.92～230、RA：1.60～400、LA：1.64～410、SaA：1.36～340、SaB：3.40～850、SaC：2.64～330、dTNI：0.96～240、cTN：2.04～255、TNI：0.27～68、TNIIa：1.12～210。對(duì)方法進(jìn)行重復(fù)性、精密度、穩(wěn)定性和加樣回收率等測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RSD值均小于 5%，表明方法穩(wěn)定、可行，可用于丹參藥材的質(zhì)量控制。

2.5樣品含量測定取新鮮和陰干丹參根樣品，根據(jù)樣品制備方法和色譜條件對(duì)丹參成分進(jìn)行測定，通過外標(biāo)法計(jì)算每克樣品的成分含量。試樣中各成分含量扣去各樣品水分含量后求得干重含量。每份樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3 次。

2.6數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均有三個(gè)獨(dú)立重復(fù)，圖表中的數(shù)據(jù)均表現(xiàn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)間顯著性，相關(guān)性與回歸分析。

3結(jié)果

3.1栽培過程中各實(shí)驗(yàn)組土壤水勢變化栽培丹參三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，干旱實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和持續(xù)干旱過程中土壤水勢變化動(dòng)態(tài)如圖1所示。結(jié)果表明在連續(xù) 12 d干旱脅迫過程中，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組土壤水分含量均呈持續(xù)下降趨勢：高水分組土壤水勢由 95%±2.0% 下降到 59%±3.2%；中水分組土壤水勢由 74%±3.1% 下降到 40%±2.5%；低水分組土壤水勢由 64%±3.8% 下降到 26%±1.1%。 統(tǒng)計(jì)分析表明三組之間水勢呈明顯差異(P<0.05)。

3.2新鮮丹參根中活性成分的含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高水分組與中水分組在 12 d的連續(xù)干旱過程中，丹參根中均未見任何丹酚酸類成分。低水分組只有在第 7 和第 12天才出現(xiàn)SaB，但仍未檢測到其他酚酸類成分(圖2)。低水分組第 7天SaB含量為 (3.26±0.26)mg·g-1，第12天為(9.84±0.43)mg·g-1。

不同土壤水分條件栽培過程中，均有較高含量丹參酮類成分(圖2)。dTNI、cTN、TNI和TNIIa的含量分別為(0.18±0.05)～(0.37±0.02)、(0.23±0.02)～(0.51±0.1)、(0.07±0.03)～(0.44±0.04)和(0.27±0.06)～(0.59±0.05)mg·g-1，四種成分總酮(TT)含量為(0.82±0.08)～(1.68±0.25)mg·g-1(圖3A-E)。

注：*P<0.05；**P<0.01)

注：a: 高水分組；b: 中水分組；c: 低水分組。4: SaB；7: dTNI；8: cTN；9:TNI；10: TNIIa。

注：dTNI：二氫丹參酮Ⅰ，cTN：隱丹參酮，TNI：丹參酮Ⅰ，TNIIa：丹參酮ⅡA；TT：總酮。

3.3陰干后丹參根中活性成分含量。將不同實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間所取丹參根樣品經(jīng)相同陰干處理。陰干以后，丹參樣本中含水量達(dá)到藥典的標(biāo)準(zhǔn)(<13%)[7]。SaB的含量顯著增加，并且在連續(xù) 12 d的干旱脅迫過程中，三實(shí)驗(yàn)組丹參樣品中SaB含量均呈持續(xù)上升趨勢(圖4A)。三組樣品中的SaB含量始終保持低水分組最高，高水分組最低。其中高水分組干旱 0天(即參照組) 的SaB含量最低為(5.66±0.32)mg·g-1；低水分組第12天SaB含量最高為(39.76±0.04)mg·g-1，達(dá)到藥典規(guī)定的 3.0%[7]，是高水分組的 6.99 倍。顯著性分析結(jié)果表明，高水分組與低水分組SaB含量差異均極顯著(P<0.01)，高水分組與中水分組SaB含量差異在干旱第 0天和第12天也達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，陰干丹參樣品中SaB含量與栽培過程中土壤水勢呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

陰干的丹參樣品中其他丹酚酸類成分含量如圖4B～F所示。除SaB外，在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的新鮮樣品中均檢測不到其他酚酸類成分。但經(jīng)過陰干處理后，酚酸類成分均顯著增加。DSS含量為(0.06±0.01)～(0.97±0.01)mg·g-1；LA含量為(1.17±0.01)～(2.03±0.05)mg·g-1； RA含量為(1.61±0.12)～(1.92±0.22)mg·g-1；SaA含量為(0.14±0.03)～(0.20±0.02)mg·g-1；SaB含量為(5.66±0.32)～(39.76±0.04)mg·g-1；SaC含量為(0. 82±0.12)～(1.22±0.04)mg·g-1。除SaB外其他酚酸類成分組內(nèi)和組間變化趨勢不明顯，差異不顯著。總酚酸含量亦顯著增加，并且在連續(xù)12 d的干旱脅迫過程中，三實(shí)驗(yàn)組丹參樣品中總酚酸含量如圖4G所示，均呈持續(xù)上升趨勢。三組樣品中的總酚酸含量始終保持低水分組最高，高水分組最低。其中高水分組取樣 0天的總酚酸含量最低,為(10.36±0.50)mg·g-1；低水分組第12天總酚酸含量最高,為(46.11±1.26)mg·g-1,是高水分組的 4.45 倍。顯著性分析結(jié)果表明，高水分組與中、低水分組總酚酸含量差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，陰干丹參樣品中總酚酸含量與栽培過程中土壤水勢呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

經(jīng)過陰干處理后，丹參酮類成分顯著增加(圖3F～J)，四種丹參酮類成分含量均顯著高于新鮮丹參根中的含量。dTNI、cTN、TNI和TNIIa的含量分別為(0.33±0.05)～(0.46±0.09)、(0.46±0.09)～(0.92±0.05)、 (0.31±0.05)～(0.51±0.03)和(0.41±0.08)～(0.77±0.09)mg·g-1，四種成分總酮(TT)含量為(1.8±0.24)～(2.38±0.31)mg·g-1(圖3F～J)。陰干后TNⅡa含量最高值是新鮮樣品的1.31倍，陰干后總酮含量最高值是新鮮樣品的1.41倍。

注：RA：迷迭香酸，LA：紫草酸，SaB：丹酚酸B，SaA：丹酚酸A，SaC：丹酚酸C；TP：總酚酸；*P<0.05；**P<0.01。

4討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，不同水分條件栽培下，丹參根中均有較高含量的丹參酮類成分；土壤水分含量為60%～90% 的高水分和40%～50%的輕度干旱栽培的新鮮丹參根中并無丹酚酸類成分產(chǎn)生。只有在極度干旱脅迫(土壤水勢<30% )時(shí)，新鮮丹參根中才可檢測到SaB(<1%)。陰干后含水量降低到 13% 左右時(shí)，丹酚酸類成分( DSS、LA、RA、SaA、SaB和SaC )含量顯著增加，其中SaB含量增加最顯著，增加約4倍；丹參酮類成分也顯著增加，增加30%以上。此外我們發(fā)現(xiàn)陰干后丹參根中丹酚酸B含量與栽培過程中土壤水勢呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)性。也就是說在栽培過程中，受到干旱脅迫程度越強(qiáng)，采收干燥后樣品中SaB含量越高。但是長期極度干旱可能影響植株長勢及生物量。所以在生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)將有效成分含量與植株長勢和生物量綜合考慮，找到既不影響根生物量又有利于丹酚酸B積累的最適栽培條件。

以上事實(shí)說明采后干燥有利于丹參活性成分積累，也進(jìn)一步說明丹參藥材中丹酚酸類成分尤其是丹酚酸B是栽培和采后極度干旱(干燥)的產(chǎn)物，且栽培過程中適度的干旱脅迫有利于丹參藥材中酚酸類成分的產(chǎn)生。因此，優(yōu)化丹參的栽培管理和采后干燥工藝對(duì)于提升丹參藥材質(zhì)量和穩(wěn)定性，以及丹參的GAP生產(chǎn)，具有至關(guān)重要的意義，值得深入研究探討。

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Effect of soil moisture on contents of bioactive components

in fresh and dried roots ofSalviamiltiorrhizaBage

WANG Wei, ZHOU Guo-jun, LI Yan,et al

(ResearchCenterofNaturalProducts,CollegeofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Abstract:Objective To verify our previous findings that salvianolic acids(SAs), especially salvianolic acid B(SaB), in roots of Salvia miltiorrhiza Bge(Danshen), were the post-harvest drying induced products; and to learn the effect of soil moisture during cultivation on contents of 6 SAs and 4 tanshinones in fresh and dried materials.Method The contents of 6 SAs and 4 tanshinones in fresh and dried samples were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results No SAs were detectable in fresh samples when soil moisture in the range of 30%～95%; whereas SaB was found in samples cultivated in extremely drought soil(moisture <30%). Tanshinones components still remain at higher levels in fresh samples. But they increased significantly after drying, especially，the SaB content reached 4.2%. Tanshinones components also increased by more than 30%. The contents of SaB and SAs in the drying roots showed a significant negative correlation with soil water potential during planting.Conclusion Post-harvest drying is conducive to the accumulation of bioactive components. All SAs in Danshen were the post-harvest drying induced products. An appropriate drought stress during cultivation is beneficial for the raise of SAs in the herb Danshen.

Key words:SalviamiltiorrhizaBge; soil moisture; post-harvest drying; salvianolic acids; tanshinones; HPLC

(收稿日期：2014-05-11，修回日期：2014-08-21)

通信作者：周銅水，男，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生藥學(xué)，E-mail: tszhou@fudan.edu.cn

作者簡介：王微，女，碩士研究生

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(No 3073883，No 81274075)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.013