甘靈茶抗氧化成分的提取工藝研究

萬 鵬，顏 顥，邵素娟，段振華

(海南大學食品學院，?？?570228)

靈芝(Ganoderma lucidum)外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形，為多孔菌科真菌靈芝的子實體。我國最早的藥學專著《神農本草經》將靈芝列為上品，有紫、赤、青、黃、白、黑六種，被稱之為:“上上之藥，方中妙品”［1］。靈芝多糖GLA、GLB、GLC 對超氧陰離子自由基(O－2 ·)的產生和紅細胞脂質過氧化均有抑制作用，并對羥基自由基(·OH)有清除作用，具有超氧化物歧化酶樣活性，是靈芝抗氧化、延緩衰老的重要因素［2-4］。

甘靈茶的原料來自于甘草和靈芝，接種過靈芝的甘草布滿了靈芝菌絲體，通過靈芝菌絲的分解，將甘草里難以被人吸收的物質轉化成易被人體吸收的成分，因而營養(yǎng)、保健與藥用價值得到了更大的提高。本文以甘靈茶為原料，從中提取抗氧化成分，以甘靈茶提取液清除DPPH 的效果為評價指標，研究甘靈茶中抗氧化成分的提取技術，并對提取液中的多酚和多糖進行測定，旨在為甘靈茶的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘靈茶，海南全仙禾生物科技有限公司提供;96%DPPH，上海源葉生物科技有限公司;95%乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、福林酚、碳酸鈉、無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸均為國產分析純。

1.2 儀器及設備

EL204 型電子天平，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;A11BS 型高速組織搗碎機，IKA 集團;HHS26S 型電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇市大地自動化儀器廠;PHS-3C 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司;722 可見分光光度計，上海奧普勒有限公司;101-2 型電熱鼓風恒溫干燥箱，常州市華普達教學儀器有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 蒽酮試劑的配制 精確稱取蒽酮2.000g，用98%濃硫酸溶解并定容至1 000mL。

1.3.2 DNS 試劑的配制 精確稱取6.5g 3，5-二硝基水楊酸溶于少量熱水，移入1000mL 容量瓶，加入2moL/L 氫氧化鈉溶液325mL，再加入丙三醇45g，搖勻，定容至1000mL。

1.4 DPPH 清除率的測定方法［5-6］

稱取DPPH 試劑7.9mg，用乙醇溶液溶解，定量轉入100mL 容量瓶中，并定容至刻度，搖勻得濃度為79.0mg/L DPPH 儲備液(2.0×10－4mol/L)置于冰箱中冷藏備用。利用DPPH 自由基的溶液特征紫紅色團的吸收峰，用分光光度法分別測定各樣品提取液在波長517nm 處吸收值。按表1 加反應液。

表1 試樣加樣表

將Ai所表示的樣品溶液在室溫下避光反應一定時間(30min)后，在517nm 處，以調零管為基準，先測定每個條件下空白對照組的吸收值(A0)，再平行測定該條件下三次吸收值(Ai)，求得清除率的平均值。DPPH 清除率的計算公式為(1)式:

DPPH 清除率(%)=1－Ai/A0×100 (1)

1.5 多酚的測定方法［7］

標準曲線的測定;采用福林—酚法。精密稱取20mg 沒食子酸標準品，蒸餾水溶解并定容至200mL 分別吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL 標準品溶液，各補水至0.5mL。然后加入10%FC 試劑2.5mL，充分搖勻。反應5min 后加入溶液7.5%Na2CO3溶液5mL，50℃水浴鍋中反應5min。室溫避光保存1h。于波長760nm 處測定吸光度。標準曲線回歸方程結果為:Y=5.398 6X+0.020 2，R2=0.995 4，Y:吸光度;X:沒食子酸質量濃度(mg/mL)。

樣品測定;吸取甘靈茶提取液0.5mL，按上述步驟操作測定吸光度，以標準曲線回歸方程和用量計算甘靈茶提取液多酚得率見(2)式。

1.6 多糖的測定方法［8］

1.6.1 總糖標準曲線的制作

采用蒽酮—硫酸法。精確量取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 葡萄糖標準液(100mg/mL)于6 支試管中，再分別加入蒸餾水至總體積為1mL，搖勻后分別加入5mL 蒽酮試劑，混勻后置于沸水浴中加熱6min，取出冷卻至室溫，以空白管為對照，在620nm 波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標，葡萄糖濃度為縱坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為:y=192.56x-0.386 7，R2=0.999 9。

樣品測定:吸取甘靈茶提取液1mL，按上述步驟操作測定吸光度，以線性回歸方程和用量計算甘靈茶提取液總糖含量。

1.6.2 還原糖標準曲線的制作

采用DNS 法。分別精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 葡萄糖標準液(1 000mg/L)，加入8 個25mL 容量瓶中，加水至總體積為2.5mL，再分別加入3mL DNS 試劑，混勻后置于沸水浴中加熱5min，取出后立即冷卻至室溫，加水定容至25mL，搖勻后，以空白管為對照，在540nm 處測定吸光度。以吸光度為橫坐標，葡萄糖濃度為縱坐標，繪制標準曲線。線性回歸方程為:y=4326.2x +101.01，R2=0.999 7。

樣品測定:吸取甘靈茶提取液2.5mL，按上述步驟操作測定吸光度，以線性回歸方程和用量計算甘靈茶提取液還原糖含量。

1.6.3 多糖含量計算

多糖含量=總糖含量－還原糖含量

1.7 試驗方法

1.7.1 單因素試驗

(1)提取溫度的確定:在蒸餾水pH 為7.0、提取時間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，提取溫度分別為40、50、60、70、80℃條件下，以提取液清除DPPH 的能力為指標，確定最佳提取溫度。

(2)pH 的確定:在提取溫度為60℃，提取時間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，溶劑(蒸餾水)pH 分別為2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 的條件下，以提取液清除DPPH 的能力為指標，確定最佳pH。

(3)提取時間的確定:在提取溫度為60℃、蒸餾水的pH 為6.5、甘靈茶用量為3%的情況下，提取時間分別為5、15、25、35、45、55min，以提取液清除DPPH 的能力為指標，確定最佳提取時間。

(4)甘靈茶用量的確定:在提取溫度為60℃、蒸餾水的pH 為6.5、提取時間為15min 的情況下，甘靈茶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%時，以提取液清除DPPH 的能力為指標，確定最佳用量。

1.7.2 測定甘靈茶提取液DPPH 清除率［9］

在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、溶劑pH、提取時間、甘靈茶用量為因素，DPPH 清除率為指標，設計了四因素三水平的正交試驗，各因素水平見表2。

表2 正交試驗設計

2 結果與討論

2.1 溫度對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在蒸餾水pH 為7.0、提取時間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，分別測定40、50、60、70、80℃等5 個不同溫度條件下的甘靈茶提取液的DPPH 清除率，結果見圖1。

從圖1 可知，隨著溫度的升高，DPPH 清除率呈現(xiàn)先上升后下降然后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。溫度在50～60℃的范圍內，曲線的斜率最大，即DPPH 清除率值增加最快，當溫度高于60℃時，曲線下降后趨于平穩(wěn)。因而提取溫度以60℃最佳。原因可能是隨著溫度的升高，抗氧化物質如多酚和多糖等滲出、擴散速率加快，從而DPPH 清除率升高，但溫度高于60℃，DPPH 清除率反而下降，這是由高溫對抗氧化物質活性不利。

圖1 不同提取溫度對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

2.2 溶劑pH 值對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在提取溫度為60℃、提取時間為15min、甘靈茶用量為3%的情況下，測定了pH 分別為2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 時甘靈茶提取液的DPPH 清除率。由圖2 可知，隨著pH 的升高，曲線開始相差不大，隨后呈先升后降的趨勢，當pH 為6.5 時，甘靈茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是是pH 過高或過低都會影響甘靈茶抗氧化物質的活性，因而取pH 為6.5 最適宜。

圖2 不同提取pH 值對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

2.3 提取時間對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在提取溫度為60℃、蒸餾水的pH 為6.5、甘靈茶用量為3%的情況下，測出提取時間分別為5、15、25、35、45、55min 的條件下對甘靈茶提取液的DPPH 清除率的影響，結果見圖3。

圖3 不同提取時間對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

由圖3 可知，隨著提取時間的增加，曲線呈先升后降的趨勢，當提取時間為15min 時，甘靈茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是時間過長多酚類等活性物質的結構發(fā)生改變，如由于多酚類羥基的氧化、偶聯(lián)作用，多酚羥基數(shù)量減少，抗氧化能力相應降低［10］，導致DPPH 清除率下降。

2.4 甘靈茶用量對甘靈茶提取液的抗氧化性影響

在提取溫度為60℃、蒸餾水的PH 為6.5、提取溫度為60℃的情況下，測出甘靈茶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%時甘靈茶提取液的DPPH 清除率，結果見圖4。

由圖4 可知，隨著甘靈茶用量的增加，曲線呈先升后降的趨勢，當甘靈茶的用量為3%時，甘靈茶提取液的DPPH 清除率最高。原因可能是隨著甘靈茶用量的增加，抗氧化活性物質的溶出、擴散速率加快，從而促進提取液中多酚、多糖等成分的提高，因此DPPH 清除率升高。當甘靈茶用量繼續(xù)增加時，在同樣的提取時間下用量大的甘靈茶浸泡不夠徹底，不利于原料中多酚、多糖的溶出，使DPPH 清除率下降。因此，甘靈茶用量取3%最佳。

圖4 不同甘靈茶用量對甘靈茶提取液DPPH 清除率的影響

2.5 甘靈茶提取液的正交試驗

根據(jù)上述單因素試驗結果，對提取溫度，提取pH，提取時間，甘靈茶用量進行了正交試驗，試驗結果及方差分析結果分別見表3 和表4?？梢钥闯龈饕蛩貙Ω熟`茶提取液影響順序為B ＞D ＞A ＞C，即提取pH 的影響最大，甘靈茶用量其次，提取溫度次之，提取時間的影響最小。從正交試驗結果看，提取溫度應選水平3 較好，提取時間選水平3 較好。但是方差分析結果表明只有提取pH 和甘靈茶用量2 個因素的影響顯著，加上節(jié)能和提取速率的考慮，決定提取溫度選水平2、提取時間選水平1 較好。綜上，最佳提取工藝為A2B3C1D2。即pH 為8.5、甘靈茶用量為3%、溫度60℃、時間15min，在此條件下DPPH 清除率為86.24%。

多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性［7，11］。最近的研究表明，靈芝多糖對細胞的抗氧化作用十分明顯［12］。為此，對提取液中的多酚和多糖分別進行了測定，發(fā)現(xiàn)多酚含量為0.187mg/mL，多糖含量為0.244mg/mL。因此，這些成分對DPPH 清除率的提高起著重要的作用。

表3 甘靈茶提取液正交試驗結果

表4 方差分析結果

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，確定了抗氧化性高的甘靈茶提取液的提取工藝，最佳工藝為提取溫度為60℃、溶劑pH 值為8.5、提取時間為15min、甘靈茶用量為3%。在此條件下DPPH 清除率為86.24%，提取液中的多酚含量為0.187mg/mL，多糖含量為0.244mg/mL。

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