大豆與乳清蛋白協(xié)同釋放必需氨基酸的動(dòng)態(tài)模式研究

任廣旭，朱大洲，張鴻儒，盧林綱，王 靖，秦玉昌

(農(nóng)業(yè)部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院雙蛋白工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與營養(yǎng)功能風(fēng)險(xiǎn)評估試驗(yàn)室，北京 100081)

運(yùn)動(dòng)能夠使機(jī)體耗氧增加，造成骨骼肌肌聯(lián)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白含量下降、膜骨架蛋白降解等不利影響，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)疲勞和損耗，降低運(yùn)動(dòng)能力。合理的營養(yǎng)改善能夠抵抗運(yùn)動(dòng)疲勞，減緩運(yùn)動(dòng)損耗［1］。乳清蛋白在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)改善領(lǐng)域已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，它能夠改變血液谷胱甘肽濃度，提高機(jī)體抗氧化能力，有效促進(jìn)肌肉生長與恢復(fù)［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白與乳清蛋白組成的雙蛋白能夠顯著增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)后肌肉蛋白的合成，但具體的分子機(jī)制尚不明確［3］。從蛋白質(zhì)氨基酸組成模式的角度分析，乳清蛋白與大豆蛋白均屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。大豆蛋白是目前所知的唯一含有9 種必需氨基酸的蛋白質(zhì)［3］。必需氨基酸尤其是支鏈必需氨基酸對肌肉蛋白的合成至關(guān)重要［4］。由于大豆蛋白與乳清蛋白具有不同的消化吸收模式，那么由大豆蛋白與乳清蛋白組成的雙蛋白在生理狀態(tài)下必需氨基酸的消化釋放模式是什么，目前尚不清楚。本研究利用Wistar 大鼠負(fù)重運(yùn)動(dòng)模型研究雙蛋白攝入后，生理狀態(tài)下必需氨基酸動(dòng)態(tài)釋放模式變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

6w 齡雄性健康潔凈級(SPF 級)Wsitar 系雄性老鼠18 只，購于北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。試驗(yàn)動(dòng)物合格證為No.11400700105348、生產(chǎn)許可證號:SCXK (京)2012-0001。飼養(yǎng)與標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由飲水，12h 光照周期，采用IVC 大鼠飼養(yǎng)系統(tǒng)。試驗(yàn)操作嚴(yán)格遵照中國動(dòng)物實(shí)用指南。

1.2 試驗(yàn)材料

蛋白質(zhì):食品級大豆分離蛋白(以下簡稱“大豆蛋白”)，干蛋白質(zhì)含量＞90%，購于山東禹王集團(tuán);乳清蛋白，干蛋白含量為94.6%，購于美國Hilmar。飼料:SPF 級大鼠維持飼料，購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

1.3 大鼠靜水游泳運(yùn)動(dòng)模型

游泳用水取自符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的生活用水，使用前進(jìn)行高溫高壓處理。水深控制在2 倍于大鼠身長［5］。根據(jù)Dawson［6］報(bào)道，水溫選擇30～35℃之間使其更接近正常大鼠體溫。通過尾巴纏繞鉛皮的方式進(jìn)行負(fù)重運(yùn)動(dòng)，負(fù)重量為每只大鼠體重的10%。在運(yùn)動(dòng)過程中隨時(shí)觀察大鼠的狀態(tài)，當(dāng)其全身浸沒水中10s 后仍不能通過努力返回水面，作為力竭發(fā)生的判斷標(biāo)準(zhǔn)［5，7］。運(yùn)動(dòng)完成后，盡快對大鼠進(jìn)行保溫處理，用毛巾將毛擦拭干后放在干燥墊料的鼠籠中。

1.4 試驗(yàn)流程

將18 只雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分成3 組，大豆蛋白組(6 只)、乳清蛋白組(6 只)和混合蛋白組(6 只)。試驗(yàn)開始前對所有大鼠進(jìn)行1w 的適應(yīng)性飼養(yǎng)，適應(yīng)期間自由飲食、飲水、每天進(jìn)行1 次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練。第二周，試驗(yàn)開始前對大鼠進(jìn)行12h 的空腹處理，12h 后通過尾巴靜脈采血收集每只大鼠的本底血，采集血量為400μL，靜置在冰上。采血后30min 進(jìn)行負(fù)重游泳，達(dá)到力竭時(shí)刻停止運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)結(jié)束10min 后，通過灌胃進(jìn)行蛋白營養(yǎng)干預(yù)，每只大鼠灌胃量為2mL，大豆蛋白、乳清蛋白及雙蛋白(大豆蛋白:乳清蛋白=1∶1)灌胃濃度 均 為200mg/2mL。灌 胃 后30、60、90、120、150min 分別采集尾靜脈血。

1.5 必需氨基酸檢測

利用串聯(lián)質(zhì)譜(LG-MS/MS，AB)測定血清中苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和組氨酸的含量。所有血清樣本氨基酸檢測均由北京迪安臨床檢驗(yàn)所完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異就有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Wistar 大鼠體征信息

為減少新環(huán)境誘發(fā)的動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，在正式試驗(yàn)前所有Wistar 大鼠需要進(jìn)行為期1w 的適應(yīng)性飼喂，適應(yīng)期間采取自由飲食的方式，每天完成一次游泳訓(xùn)練，以消除大鼠對游泳的恐懼。第二周，試驗(yàn)前檢測每只大鼠體重，乳清蛋白組體重為284.8 ±12.2g、大豆蛋白組體重為276±10.9g、雙蛋白組體重288.8±1.64g (附表)。對于大鼠來說，單純的自然游泳運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度很小，不利于評價(jià)抗性運(yùn)動(dòng)后營養(yǎng)補(bǔ)充后氨基酸釋放的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，因此為了評價(jià)抗性運(yùn)動(dòng)后營養(yǎng)補(bǔ)充對必需氨基酸的動(dòng)態(tài)釋放規(guī)律，游泳時(shí)需要尾部負(fù)重。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)選擇10%的體重為最佳負(fù)重量(附表)。負(fù)重運(yùn)動(dòng)開始后計(jì)錄每只大鼠的力竭時(shí)間，乳清蛋白組86.8 ±25.9s、大豆蛋白組88.1 ± 43.7s、雙蛋白組83.1±16.0s。

2.2 支鏈必需氨基酸濃度動(dòng)態(tài)變化

一次性力竭運(yùn)動(dòng)后，將3 組大鼠分別攝入相同濃度(200mg/2mL)的乳清蛋白、大豆蛋白和雙蛋白。結(jié)果顯示:3 組蛋白干預(yù)模式下支鏈必需氨基酸的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律相似。亮氨酸動(dòng)態(tài)變化(圖1 A):蛋白攝入后30min，3 組亮氨酸濃度均到達(dá)峰值。乳清蛋白和雙蛋白峰值濃度相同，顯著高于大豆蛋白組。與乳清蛋白相比，蛋白攝入后120min 內(nèi)能夠保持持續(xù)性的高濃度亮氨酸。第150min 3 組血清亮氨酸濃度恢復(fù)一致。異亮氨酸動(dòng)態(tài)變化(圖1 B):第30min 乳清蛋白和雙蛋白所釋放的異亮氨酸濃度相同，但是乳清蛋白此時(shí)已經(jīng)達(dá)到峰值，而大豆蛋白組和雙蛋白組均在60min 達(dá)到峰值。從30～120mim 雙蛋白組異亮氨酸濃度持續(xù)性高于其他兩組，大豆蛋白則相較于其他兩組異亮氨酸濃度含量一直處于較低水平。纈氨酸動(dòng)態(tài)變化(圖1 C):3 組纈氨酸血清濃度都在第60min 達(dá)到峰值，在此期間乳清蛋白組與雙蛋白組纈氨酸釋放濃度水平一致，均高于大豆蛋白組。從60～150min，乳清蛋白組纈氨酸濃度開始低于雙蛋白組，但始終高于大豆蛋白組。

附表 Wistar 大鼠基本體征信息

圖1 支鏈必需氨基酸濃度動(dòng)態(tài)變化

圖2 非支鏈必需氨基酸濃度動(dòng)態(tài)變化

2.3 非支鏈必需氨基酸濃度動(dòng)態(tài)變化

非支鏈氨基酸中賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸和甲硫氨酸在3 種營養(yǎng)干預(yù)中沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。3 組必需氨基酸的變化規(guī)律相似，除蘇氨酸外，其余氨基酸都在蛋白攝入后第30min 達(dá)到了各自的釋放峰值(圖2 A、B、C、E、F)。色氨酸的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律:雙蛋白組從蛋白攝入后第30～150min，色氨酸濃度都顯著高于乳清蛋白組。乳清蛋白組則從第60～150min 與大豆蛋白所釋放的色氨酸濃度趨于一致。最后，3 組色氨酸濃度在第150min 達(dá)一致。

3 討論

由于不同蛋白質(zhì)氨基酸組成模式和種類不同，加之高級結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在消化過程中氨基酸釋放速率和模式不盡相同。乳清蛋白易溶于酸性溶液，胃部強(qiáng)酸的環(huán)境能夠加速其消化降解屬與快速降解蛋白，相對于乳清蛋白大豆蛋白則屬于緩慢降解蛋白［8］。最近，美國德克薩斯醫(yī)學(xué)中心Basmussen 研究小組通過臨床隊(duì)列研究揭示大豆蛋白與乳清蛋白組成的雙蛋白能更有效地促進(jìn)抗性運(yùn)動(dòng)后肌肉蛋白合成［9］，然而，目前尚不清楚乳清蛋白與大豆蛋白之間是如何發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)運(yùn)動(dòng)后肌肉恢復(fù)。研究顯示，必需氨基酸尤其是以亮氨酸為代表的支鏈必需氨基酸對于肌肉蛋白的合成至關(guān)重要［4］。大豆蛋白含有16 種氨基酸，是目前已知的唯一含有9 種必需氨基酸的蛋白質(zhì)［10］，乳清蛋白則含有人體必需的8 種氨基酸，且支鏈氨基酸含量豐富［11］。

本研究結(jié)果表明，Wistar 大鼠在完成一次性力竭游泳后，無論單獨(dú)或是混合攝入2 種蛋白均能在干預(yù)后的30～60min 內(nèi)達(dá)到必需氨基酸的釋放峰值。由于支鏈氨基酸對于運(yùn)動(dòng)后肌肉的恢復(fù)至關(guān)重要，因此我們分別將9 種必需氨基酸根據(jù)分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分成支鏈氨基酸和非支鏈氨基酸兩組。蛋白攝入后的前30min 內(nèi)，乳清蛋白組和雙蛋白組血液中支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)的濃度相似，都顯著高于大豆蛋白組。這可能是由于大豆蛋白的消化速率低于乳清蛋白所造成的，在前30min 內(nèi)大豆蛋白尚未完全消化釋放，雙蛋白組血液中支鏈氨基酸主要來自于乳清蛋白，從而形成前30min 乳清蛋白組與雙蛋白組差異不明顯。從30～120min 雙蛋白組血液中支鏈氨基酸濃度顯著高于乳清蛋白組，而大豆蛋白組依然低于乳清蛋白組。從30min后，雙蛋白組中大豆蛋白開始逐步達(dá)到釋放峰值(異亮氨酸和纈氨酸的釋放峰值時(shí)間為第60min)。與乳清蛋白相比，雙蛋白組此后持續(xù)性的高支鏈氨酸釋放可能是由于大豆蛋白釋放的高峰階段的疊加效應(yīng)以及乳清蛋白釋放不足共同決定的。120min 以后，3 種干預(yù)之間支鏈氨基酸的釋放水平恢復(fù)一致，沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，非支鏈氨基酸中出色氨酸外，3 種不同干預(yù)所釋放的氨基酸水平和動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)基本一致，沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而對于色氨酸來說，雙蛋白干預(yù)組濃度始終顯著高于乳清蛋白組和大豆蛋白組，大豆蛋白濃度在所檢測的時(shí)間點(diǎn)均低于乳清蛋白組。

綜上所述，運(yùn)動(dòng)后攝入“大豆+乳清”雙蛋白能夠維持高濃度的色氨酸及支鏈氨基酸持續(xù)性釋放，單獨(dú)補(bǔ)充乳清蛋白只能短暫地(蛋白攝入后30min)增加血液中支鏈氨基酸濃度，單獨(dú)補(bǔ)充大豆蛋白則能持續(xù)性地維持低濃度的支鏈氨基酸。對于賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、組氨酸和甲硫氨酸2 種蛋白的單獨(dú)攝入或混合攝入不影響除色氨酸外的其他非支鏈氨基酸的濃度釋放水平。因此，本研究揭示，運(yùn)動(dòng)后及時(shí)補(bǔ)充“大豆+乳清”雙蛋白能夠更持久地保持高濃度色氨酸和支鏈氨基酸的釋放。

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