廣東省惠州地區(qū)基于醫(yī)院水平的地中海貧血基因突變譜分析

鐘澤艷 陳劍虹 賀海林 官志揚(yáng) 徐志邦 鐘艷娟 閆 梅 黃紫娟

廣東省惠州市第一婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（516007）

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是一種單基因遺傳性溶血性貧血病，全球有2%的人口為地貧攜帶者，我國(guó)南方高發(fā)地區(qū)人群攜帶率為1%～24%［1－2］。臨床上以α和β地貧為最常見，研究表明廣東省α和β地貧的發(fā)生率分別高達(dá)8.53%和2.54%［3］。在最新的廣東省大規(guī)模人群地貧攜帶率的基線調(diào)查中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)廣東省21個(gè)地級(jí)市的平均地貧基因攜帶率高達(dá)16.83%［4］。根據(jù)臨床表征，α地貧可分為靜止型、輕型、中間型和重型；β地貧可分為輕型、中間型和重型。目前，此病癥仍然沒有理想有效的治療方法，因此做好預(yù)防和監(jiān)控對(duì)控制和降低地貧的發(fā)病率非常重要。同時(shí)，惠州市是客家人的重要聚居地和集散地之一，最近的研究發(fā)現(xiàn)客家人的地貧基因攜帶率高［5］。因此，本研究對(duì)2014年4～9月在本院就診的患者，進(jìn)行地貧的篩查和基因診斷，以期獲得惠州地區(qū)地貧基因攜帶率、基因型分布規(guī)律，為降低出生缺陷積累資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年4～9月，每個(gè)月電腦系統(tǒng)隨機(jī)抽取我院的200例門診患者和住院患者，共抽取2000例，患者的性別和年齡無(wú)限制。根據(jù)知情同意的原則，獲取外周靜脈血樣本2ml。先血液學(xué)篩查地貧陽(yáng)性樣本，對(duì)其中540例愿意進(jìn)一步檢查的患者進(jìn)行血紅蛋白電泳分析，進(jìn)一步采用多重PCR和反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)對(duì)血紅蛋白結(jié)果異常樣本進(jìn)行地貧基因診斷，產(chǎn)前診斷中心對(duì)可能會(huì)分娩中重型地貧患兒的孕婦行羊膜腔穿刺術(shù)。采集胎兒羊水樣本兩管，一管直接法檢測(cè)（培養(yǎng)前），另一管按照本中心建立的常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后檢測(cè)。

1.2 研究方法

1.2.1 血液學(xué)篩查 采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞平均容積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量（MCH）等。初篩血液學(xué)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為：MCV＜82.0fl或（和）MCH＜27.0pg。抽取血液學(xué)篩查陽(yáng)性樣本540例采用全自動(dòng)血紅蛋白電泳儀檢測(cè)血紅蛋白A（HbA）、血紅蛋白 A2（HbA2）、HbF和異常血紅蛋白條帶。血紅蛋白電泳，分別以 HbA2＜2.5%或（和）出現(xiàn)異常血紅蛋白帶（HbH，Hb Bart＇s）判定為α地貧表型陽(yáng)性，HbA2＞3.5%判定為β地貧表型陽(yáng)性［6］。

1.2.2 基因型分析 對(duì)其中電泳分析異常的樣本使用廣東省潮州凱普生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒［5，7］進(jìn)行基因分析，同時(shí)檢測(cè)中國(guó)人常見的3種α缺失型地貧（--SEA／、-α4.2／、-α3.7／），3種α非缺失型地貧（αWSα／、αCSα／、αQSα／），16種β地貧［（CD41－42（－TTCT）、CD17（A－T）、CD43（G－T）、CD71－72（＋A）、IVS－I－I（G－T，G－A）、IVS－1－5（G－C）、IVS－II－654（C－T）、－28（A－G）、－29（A－G）、Cap（－AAAC）、Int（TG）、CD14－15（＋G）、CD27－28（＋C）、βE（G－A）、CD31（－C））］。按照操作說(shuō)明書進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。未有正常對(duì)照點(diǎn)的突變點(diǎn)或血液學(xué)篩查結(jié)果陽(yáng)性而基因型在檢測(cè)范圍內(nèi)的正常樣本，進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，分析受檢人群地貧基因攜帶率和基因型分布規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 血液學(xué)結(jié)果

根據(jù)血液學(xué)初篩陽(yáng)性樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)，在隨機(jī)抽取的2000例外周血樣本中，檢出表型陽(yáng)性樣本912例，陽(yáng)性率為45.60%。在所抽540例血紅蛋白電泳分析結(jié)果中，檢出血紅蛋白結(jié)果異常425例，陽(yáng)性率為78.70%。其中，判定為α地貧表型陽(yáng)性284例（66.82%）；判定為β地貧表型陽(yáng)性141例（33.18%）。

2.2 地貧基因的攜帶率、基因型及分布規(guī)律

425例血紅蛋白結(jié)果異常樣本經(jīng)基因檢測(cè)，結(jié)果顯示地貧基因攜帶者360例，基因陽(yáng)性率為84.71%。推算本地區(qū)基于醫(yī)院的地貧基因攜帶率為30.40%［（912×360／540）／2000］。共檢出35種基因型，包括α地貧226例，占62.78%，主要基因型為--SEA／αα、-α3.7／αα、-α4.2／αα；β地 貧 112 例，占31.11%，主要基因型為CD41－42／N、IVS－II－654／N、－28／N；α地貧合并β地貧的復(fù)合型地貧22例，占6.11%，主要基因型為--SEA／αα合并IVS－II－654／N、--SEA／αα合并 CD41－42／N、αWSα／αα合并 CD41－42／N。具體基因型及其構(gòu)成比詳見表1。在所有樣本中，檢出中間型地貧12例，兩種罕見型β地貧各1例，分別為CD113／N（T－A，Hb New York）和SEA－HPFH／N，這兩例樣本在血紅蛋白電泳分析中分別檢出39.19%HbK和19.92%HbF，詳見圖1、圖2。

表1 360例地貧基因攜帶者基因突變類型及分布情況

圖1 罕見型β地貧CD113／N測(cè)序圖

圖2 缺失型β地貧SEA－HPFH／N電泳圖

2.2 夫妻地貧基因攜帶率及產(chǎn)前診斷

912例篩查陽(yáng)性樣本中包括205對(duì)夫妻（年齡18～49歲），均進(jìn)行了血紅蛋白電泳分析，同時(shí)經(jīng)基因檢測(cè)，所有夫妻中地貧基因攜帶者有189例。共檢出21種基因型，α地貧120例，占63.49%，主要基因型為--SEA／αα、-α3.7／αα、-α4.2／αα，占95.83%；β地貧60例，占31.75%，主要基因型為 CD41－42／N、IVS－II－654／N、－28／N，占90%；α地貧合并β地貧的復(fù)合型地貧9例，占4.76%，主要基因型為--SEA／αα合并CD41－42／N、-α3.7／αα合并IVS－II－654／N、αWSα／αα合并CD41－42／N，占44.44%。其中，攜帶同型地貧基因夫妻44對(duì)，占21.46%。根據(jù)基因結(jié)果判斷可能會(huì)分娩中重型地貧患兒的夫妻共36對(duì)，經(jīng)行羊膜腔穿刺術(shù)檢查，發(fā)現(xiàn)24例胎兒為地貧攜帶者，檢出率為66.67%；重型地貧胎兒7例，占29.17%。具體基因型詳見表2。胎兒引產(chǎn)后留取臍帶血，經(jīng)地貧基因診斷與產(chǎn)前診斷結(jié)果一致，且重型α地貧胎兒進(jìn)行B超檢測(cè)均存在水腫和心胸比例增大。

表2 36例羊水基因診斷結(jié)果

3 討論

地貧主要是由于珠蛋白基因的缺失或突變使珠蛋白基因的表達(dá)受到抑制，引起相應(yīng)的珠蛋白鏈合成減少甚至完全不能合成，導(dǎo)致α與非α肽鏈比例失衡所引起的遺傳性溶血性貧血。隨著政府和社會(huì)對(duì)地貧防控的重視，通過(guò)地貧防控知識(shí)的宣教，人們的認(rèn)識(shí)水平得到了很大程度提高。惠州市地處地貧高發(fā)區(qū)的廣東省中南部，從地域和人群上推斷存在地貧高攜帶率的可能。

本研究以本院就診的患者為研究對(duì)象，2000例外周血樣本中，血液學(xué)篩查陽(yáng)性率為45.60%。540例血紅蛋白電泳分析結(jié)果異常425例，推測(cè)本地區(qū)基于醫(yī)院患者的血紅蛋白電泳陽(yáng)性率為35.89%。其中，判定為α地貧者占66.82%，β地貧者占33.18%，兩者比例約為2∶1。經(jīng)基因檢測(cè)，檢出α地貧、β地貧和復(fù)合型地貧的基因攜帶者共360例，血紅蛋白電泳分析結(jié)果陽(yáng)性率與基因型檢出率的一致性為84.71%。綜合分析，惠州地區(qū)基于醫(yī)院患者的地貧基因攜帶率約為30.40%，也再次驗(yàn)證α地貧比β地貧和復(fù)合型地貧的基因攜帶率高。與以往研究報(bào)道相比較，該地區(qū)地貧基因攜帶率明顯高于廣東省的許多其他地區(qū)［3－5］和中國(guó)南方的其他省份，包括廣州（6.20%）［8］、深圳（6.49%）［9］、梅州（12.24%）［5］、江西（16.02%）［10］、福建（4.41%）［11］、廣西（24.51%）［12］，且僅低于海南（53.45%）［13］。雖然本研究基于醫(yī)院水平，研究人群存在一定的偏倚，但是該結(jié)果仍然可反映出惠州地區(qū)具有很高的地貧基因攜帶率，屬于地貧高發(fā)區(qū)。截至2013年底，惠州市常住人口為470萬(wàn)人，由此推測(cè)該地區(qū)地貧的攜帶者約為143萬(wàn)人，加強(qiáng)該地區(qū)地貧防控任重而道遠(yuǎn)。

本研究中，共檢出35種基因型，其中α地貧基因型 10 種，以--SEA／αα、-α3.7／αα、-α4.2／αα 為 主，占92.04%。從臨床分型來(lái)看，靜止型、輕型和中間型構(gòu)成比分別為80.97%、13.72%和5.31%，可見輕型在臨床所占比例最多，這與輕型中的基因型以東南亞型為主有關(guān)。β地貧基因型檢出12種，以CD41－42／N、IVS－II－654／N、－28／N 為主，占83.93%，并且包含了兩種罕見基因型CD113／N（Hb New York）和SEA－HPFH／N。罕見型地貧的檢出說(shuō)明進(jìn)行血液學(xué)篩查和血紅蛋白電泳分析具有很重要的提示意義，有助于發(fā)現(xiàn)罕見型地貧的存在，降低漏診率。進(jìn)一步證實(shí)，HbF是判定β地貧的重要依據(jù)之一，但由于影響的因素較多，單獨(dú)HbF增高不能判定β地貧，只能提示可能為β地貧。復(fù)合型地貧基因型檢出13種，以--SEA／αα合并IVS－II－654／N、--SEA／αα合并CD41－42／N、αWSα／αα合并 CD41－42／N 為主，占45.45%。由統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以看到惠州地區(qū)人群中無(wú)論是α地貧還是β地貧，抑或復(fù)合型地貧的主要基因型分布情況與其他報(bào)道［3－13］相同。

本研究中，共有205對(duì)夫妻進(jìn)行了地貧篩查和基因診斷。經(jīng)基因檢測(cè)，檢出44對(duì)為同型地貧基因攜帶者，根據(jù)結(jié)果判定36對(duì)夫妻需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。在遵循產(chǎn)前診斷知情同意的原則下，均完成了高風(fēng)險(xiǎn)胎兒羊水的產(chǎn)前診斷。結(jié)果顯示24例為地貧攜帶者，包括7例重型、2例中間型、9例輕型、靜止型和復(fù)合型各3例。根據(jù)基因診斷結(jié)果，對(duì)于7例重型地貧胎兒遺傳咨詢醫(yī)生建議終止妊娠，其他基因型的胎兒則解釋清楚地貧的遺傳特征以及攜帶者可能出現(xiàn)的臨床表征，強(qiáng)調(diào)若下次妊娠仍需進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷［14］。本研究中，6個(gè)月時(shí)間內(nèi)阻止了7例重型地貧患兒的出生，證明通過(guò)對(duì)高危者進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，可有效減少重型地貧患兒的出生，減少出生缺陷。

綜上，惠州地區(qū)人群的地貧攜帶率很高，基因型分布特征與其他地區(qū)相似，為地貧防控提供了科學(xué)依據(jù)。鑒于地貧目前尚無(wú)有效的治療方法，而重型患兒的出生會(huì)給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，通過(guò)產(chǎn)前篩查和基因診斷避免重型地貧患兒的出生及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生是最根本的措施。因此，加強(qiáng)惠州地區(qū)的地貧篩查和基因診斷，擴(kuò)展優(yōu)生優(yōu)育的服務(wù)面，進(jìn)行地貧的遺傳咨詢與產(chǎn)前診斷具有重要意義。

［1］ Cooley TB，Lee P.Series of cases of splenomegaly in children with anemia and peculiar bone changes［J］.Tians Am pediatr Soc，1925，37：29－30.

［2］ Weatherall DJ.Hemoglobinopathies worldwide：present and future［J］.Curr Mol Med，2008，8（7）：592－599.

［3］ Xu XM，Zhou YQ，Luo GX，et al.The prevalence and spectrum of alpha and beta thalassaemia in Guangdong Province：implications for the future health burden and population screening［J］.J Clin Pathol，2004，57：517－522.

［4］ Yin AH，Li B，Luo MY，et al.The Prevalence and Molecular Spectrum of a－and b－Globin Gene Mutations in 14，332Families of Guangdong Province，China［J］.PLoS One，2014，9（2）：e89855.

［5］ Lin M，Wen YF，Wu JR，et al.Hemoglobinopathy：molecular epidemiological characteristics and health effects on Hakka people in the Meizhou region，southern China［J］.PLoS One，2013，8（2）：e55024.

［6］ 呂福通，謝丹尼.地中海貧血的相關(guān)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2013，21：490－494.

［7］ Lin M，Zhu JJ，Wang Q，et al.Development and evaluation of a reverse dot blot assay for the simultaneous detection of common alpha and beta thalassemia in Chinese［J］.Blood Cells Molecules and Diseases，2012，48：86－90.

［8］ Liao C，Mo QH，Li J，et al.Carrier screening for alpha－and beta－thalassemia in pregnancy：the results of an 11－year prospective program in Guangzhou Maternal and Neonatal hospital［J］.Prenat Diagn，2005，25：163－171.

［9］ Li Z，Li F，Li M，et al.The prevalence and spectrum of thalassemia in Shenzhen，Guangdong Province，People＇s Republic of China［J］.Hemoglobin，2006，30：9－14.

［10］ Lin M，Zhong TY，Chen YG，et al.Molecular epidemiological characterization and health burden of thalassemia in Jiangxi Province，P.R.China［J］.PLoS One，2014，9（7）：e101505.

［11］ 徐兩蒲，黃海龍，王燕，等.福建省籍各地市人群地中海貧血的分子流行病學(xué)研究［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2013，30（4）：403－406.

［12］ Xiong F，Sun M，Zhang X，et al.Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China［J］.Clin Genet，2010，78（2）：139－148.

［13］ Yao H，Chen X，Lin L，et al.The spectrum ofα-andβthalassemia mutations of the Li people in Hainan Province of China［J］.Blood Cells Mol Dis，2014，53（1－2）：16－20.

［14］ Cao A，Kan YW.The Prevention of Thalassemia［J］.Cold Spring Harb Perspect Med，2013，3（2）：a011775.