杭白芷根的分泌道超微結構與其揮發(fā)油分泌的關系

陳 瑩,胡正海,胡本祥,沈 霞,顏永剛

(1 陜西中醫(yī)學院 藥學院,陜西咸陽 712046;2 西北大學 西部資源生物與現代生物技術省部共建教育部重點實驗室,西安 710069)

杭白芷根的分泌道超微結構與其揮發(fā)油分泌的關系

陳 瑩1,胡正海2,胡本祥1,沈 霞1,顏永剛1

(1 陜西中醫(yī)學院 藥學院,陜西咸陽 712046;2 西北大學 西部資源生物與現代生物技術省部共建教育部重點實驗室,西安 710069)

利用光鏡及透射電子顯微鏡技術研究了杭白芷根中分泌道結構及其揮發(fā)油的分泌,并重點探討分泌道中揮發(fā)油的分泌過程。結果顯示:(1)杭白芷的分泌道是由上皮細胞圍繞著的伸長的胞間隙,腔道內貯存著揮發(fā)油。(2)分泌道細胞的質體、細胞基質以及線粒體參與揮發(fā)油或其前體物質的合成。(3)在分泌道發(fā)育的后期,大量小泡與分泌細胞的液泡膜和細胞質膜融合,將其內的物質釋放進入空腔。研究認為,杭白芷分泌道中揮發(fā)油主要合成部位為質體及細胞基質,之后以擴散滲透或通過膜質小泡與液泡及質膜融合這兩種方式分泌到空腔內,豐富的線粒體可能為這一系列過程提供能量。

杭白芷;發(fā)育;分泌道;揮發(fā)油;分泌

中藥白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosanaBoiss.Shan et Yuan]的干燥根[1],始載于《神農本草經》,因初生根桿為芷,色白,故名白芷,是一種臨床常用的解表藥,在治療各種類型的疼痛癥狀中出現的頻率相當高?，F代所用的白芷均為栽培品,以四川、河北、河南、浙江為四大歷史產區(qū)[2]。近年來有關白芷化學成分及藥理作用方面的研究已比較深入,以川白芷、杭白芷、祁白芷報道最多[2-4]。而其主要的入藥部位是根,其主要的藥用成分如揮發(fā)油、黃酮類等在根中產生,但其積累和分泌過程尚不清楚。雖然目前多數文獻報道杭白芷根中有分泌腔分布,杭白芷分泌結構究竟是分泌道還是分泌腔？分泌結構中揮發(fā)油究竟如何分泌？本研究通過透射電鏡技術對杭白芷根中分泌道的超微結構以及發(fā)育過程中揮發(fā)油的分泌過程進行了系統(tǒng)研究,以期為探討分泌道的超微結構與揮發(fā)油分泌的關系提供依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

分別于2012、2013年在陜西中醫(yī)學院藥學院藥草園內,采集一年生和二年生杭白芷植株的根、莖、葉為試驗材料。

1.2 方 法

1.2.1 石蠟切片法和組織化學法 利用石蠟切片法對白芷不同營養(yǎng)器官在分泌道結構及分布進行觀察,取白芷不同部位(根、莖、葉)分割成0.5～1.0 cm長的片段,以FAA固定,常規(guī)石蠟切片,厚度5～10 μm,番紅-固綠染色,中性樹膠封片,Leica DMLB顯微鏡觀察并照相。利用蘇丹Ⅲ溶液進行揮發(fā)油的組織化學定位,取新鮮的白芷根,制備徒手切片,切片厚度約50 μm,以蘇丹Ⅲ溶液染色后稍加熱,然后用稀甘油處理,Cx21Fs1型(日本OLYMPUS)顯微鏡觀察并照相。

1.2.2 半薄切片法 利用半薄切片法對白芷根中分泌道進行觀察,取不同發(fā)育時期的杭白芷的根,分割成0.5×0.5×1 mm的小塊,固定于4%戊二醛(0.1 mol/L磷酸緩沖液配制,pH 7.2)中,低溫4 ℃固定,過夜,緩沖液沖洗,1%鋨酸室溫后固定2 h,緩沖液沖洗,系列酒精脫水,環(huán)氧丙烷過渡,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,Reichert-Jung切片,切片厚1～2 μm,TBO染色[5],Leica DMLB顯微鏡觀察并照相。

1.2.3 超薄切片法 上述材料Leica EM UC6切片機切片,切片厚70～90 nm,醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,H-7650(Hitachi,Japan)透射電鏡下觀察分泌細胞超微結構并照相。

2 觀察結果

2.1 杭白芷分泌道的光鏡結構及分布

杭白芷的分泌道是由分泌細胞圍繞著的伸長的胞間隙(圖版Ⅰ,1、2),腔道內貯存著揮發(fā)油(圖版Ⅰ,3)。在杭白芷根、莖、葉中均有分泌道存在。在根中,分泌道主要分布在中柱鞘薄壁組織和次生韌皮部中(圖版Ⅰ,4);在莖中,主要存在于皮層和髓中(圖版Ⅰ,5、6);在葉中,主要存在于葉脈薄壁組織中(圖版Ⅰ,7)。杭白芷根的初生結構無分泌道(圖版Ⅰ,8),因此杭白芷根中分泌道屬于次生分泌道,而莖中分泌道主要分布于皮層和髓中,且多存在于木質部和韌皮部相對處,在葉中分泌道分布在維管束的上、下組織中,這些分泌道均屬初生分泌道。

2.2 分泌道的超微結構觀察

杭白芷中成熟的分泌道是由一層分泌細胞和空腔所構成,周圍沒有鞘細胞。早期分泌細胞與周圍細胞的差別不大,體積較小。隨后分泌細胞細胞壁之間逐漸相互分離,形成空腔(圖版Ⅱ,1)。此時分泌細胞仍具有明顯的細胞學特征:細胞質濃厚,具小液泡,同時具有明顯的細胞核,細胞壁薄,質體豐富且質體中含有高電子密度物質(圖版Ⅱ,1、2)。之后空腔逐漸擴大,分泌細胞也發(fā)生改變,小液泡逐漸融合形成較大液泡,有明顯的線粒體、內質網及質體(圖版Ⅱ,3、4),質體中有灰黑色的嗜鋨滴(圖版Ⅱ,4),同時,高電子密度物質也出現在空腔和液泡中(圖版Ⅱ,5、6)。同時,在質體中嗜鋨滴附近出現膜系統(tǒng)降解的類囊膜鞘結構,質體周圍出現大量高電子密度黑色團塊(圖版Ⅱ,7),液泡內一些嗜鋨滴周圍也圍繞著大量黑色團塊(圖版Ⅱ,8),與質體周圍的高電子密度物質類似(圖版Ⅲ,1)。隨著分泌道擴大,大液泡不斷增大,占據了細胞的大部分,細胞核、質體、線粒體、內質網均可見(圖版Ⅲ,2～5),在空腔內和液泡內進一步積累大量高電子密度物質(圖版Ⅲ,2、3),同時液泡內出現同心環(huán)狀的膜結構,包圍著黑色團塊(圖版Ⅲ,6),液泡周圍存在大量線粒體(圖版Ⅲ,7)。隨后,在空腔及液泡周圍出現大量由膜包被的黑色團塊物質(圖版Ⅲ,8;圖版Ⅳ,1),并且這些膜質小泡與液泡膜和質膜逐漸融合并釋放其內容物(圖版Ⅳ,2～4)。進入成熟期,成熟的分泌道是由一層分泌細胞構成,沒有鞘細胞,此時各細胞器已被大液泡擠到緊貼質膜的位置,細胞器的數量也減少直至消失。到分泌道發(fā)育的后期,小泡內的物質減少并與質膜開始融合(圖版Ⅳ,5),同時分泌細胞中細胞器數量減少,質體、高爾基體被大液泡擠到質膜附近(圖版Ⅳ,4、6、7),細胞核出現內折現象(圖版Ⅳ,8)。

3 討 論

大量文獻中報道白芷根中存在分泌腔或油室,根據本實驗從杭白芷根的縱切面上來看,其分泌結構呈長管狀,應屬于分泌道。整個發(fā)育過程中沒有觀察到細胞破毀,空腔形成是由分泌細胞細胞壁之間逐漸相互分離而來的,因此,白芷根中分泌道應屬于裂生型,與Fahn[6]對傘形科分泌組織的描述一致。而超微結構觀察結果表明,分泌道與揮發(fā)油合成和分泌存在密切關系。精油的生化研究表明,它是植物次生代謝產物,主要是含有揮發(fā)性的分子量小的萜類物質成分[6],分為單萜、倍半萜、二萜等幾類。單萜是由單萜合成酶或環(huán)化酶催化牦牛兒苗基二磷酸(GPP)的合成反應而來的,眾多的研究均表明質體是其專一性的合成部位[7]。由于倍半萜合成酶位于細胞質中,其性質與單萜合成酶相似。因而FPP及倍半萜的合成,一般認為是在細胞溶質及內質網與細胞溶質的交界面處[8-9]。二萜合成酶的基本性質與單萜和倍半萜合成酶性質相似,合成也在質體上[7]。結合本實驗在杭白芷中的觀察結果,在分泌道發(fā)育過程中,嗜鋨滴及黑色團塊物主要分布在質體和細胞質,因此,精油的主要合成部位為質體和細胞質。這些觀察與生化合成的研究結果是基本一致的,同時,在上述精油合成、加工和轉運過程中,有大量線粒體存在,豐富的線粒體可能為這一系列過程提供能量,同時看到大量膜質小泡包裹黑色團塊物質并與液泡膜和細胞質膜融合,說明膜質小泡與精油分泌的關系密切,而且在分泌細胞內可見高爾基體及內質網降解形成的同心環(huán)狀膜結構,說明高爾基體和內質網也可能參與了膜質小泡的形成,幫助細胞完成轉運過程。杭白芷根中分泌道的分泌細胞中精油主要合成部位是質體和細胞質,之后以擴散滲透或通過膜質小泡與液泡及質膜融合這兩種方式分泌到空腔內,類似的結果在蔡霞等[10]對北柴胡分泌道中揮發(fā)油分泌的研究也有報道,這為探討傘形科植物精油合成場所和轉運提供了更多的細胞學證據,生化途徑和機制還有待進一步研究。

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圖版說明:

SC.分泌道;SP.次生韌皮部;SX:次生木質部;VB.維管束;Ph.韌皮部;X.木質部;E.表皮;C.皮層;CC.中柱;L.空腔;M.線粒體;N.細胞核;P.質體;V.液泡;Ms.類囊膜鞘結構;G.高爾基體

Explanation of plates:

SC.Secretory canals;SP.Secondary phloem;SX.Secondary xylem;VB.Vascular bundles;Ph.Phloem;X.Xylem;E.Epiderm;C.Cortex;CC.Central cylinder;L.Lumen;M.Mitochondria;N.Nucleolus;P.Plastid;V.Vacuole;MS.Myelin-like structures;G.Golgi apparatus

圖版 Ⅰ 1.白芷根縱切,×400;2.白芷根橫切,×400;3.白芷根橫切,蘇丹Ⅲ染色,×100;4.白芷根橫切,示次生結構,×100;5.白芷莖橫切,示莖初生結構,×100;6.白芷莖橫切,示維管束×400;7.葉橫切,示葉片結構,×400;8.根尖橫切,示根的初生結構,×400。

Plate Ⅰ

Fig.1.Longitudinal section of the root,×400;

Fig.2.Cross section of the root,×400;

Fig.3.Cross section of the root staining with Sultan Ⅲ,×100;

Fig.4.Cross section of the root showing secondary structure,×100;

Fig.5.Cross section of the stem showing primary structure,×100;

Fig.6.Cross section of the stem showing vascular bundle,×400;

Fig.7.Cross section of the leaf showing primary structure,×400;

Fig.8.Cross section of the root tip showing primary structure,×400.

圖版 Ⅱ 1.分泌道早期;2.分泌細胞,示細胞核;3.分泌道,示空腔形成;4.分泌細胞,示各細胞器;5.空腔中出現高電子密度物質;6.液泡中出現同心環(huán)狀膜結構;7.質體中出現類囊膜鞘結構;8.液泡中出現黑色團塊物。

Plate Ⅱ

Fig.1.TEM micrographs of secretory initial cells;

Fig.2.Secretory cells,showing nucleolus;

Fig.3.A developing secretory canal,showing lumen;

Fig.4.Secretory cells,showing mitochondria,plastid;

Fig.5.Part of a secretory cells,showing osmiophilic droplet in lumen;

Fig.6.Part of a secretory cells,showing vacuole with concentric ring structure;

Fig.7.Plastid which have myelin-like structures;

Fig.8.Vacuole which have diffusion-shaped black masses which instruct with the five-pointed star.

圖版 Ⅲ 1.膜質小泡;2.空腔中積累大量高電子密度物質,示細胞核;3～5.各細胞器,線粒體、質體及高爾基體;6.同心環(huán)狀結構;7.大液泡將細胞器擠向一側;8.膜質小泡。

Plate Ⅲ

Fig.1.Vesicles in cytoplasm;

Fig.2.Showing the lumen with numerous osmiophilic droplets;

Fig.3-5.Secretory cells,showing mitochondria,plastid,dictyosome;

Fig.6.Concentric ring structure in vacuole;

Fig.7.Part of a developing secretory canal,showing a large center vacuole in a secretory cell;

Fig.8.Vesicles in vacuole.

圖版 Ⅳ 1.空腔中出現膜質小泡;2.膜質小泡釋放內容物;3.膜質小泡與液泡膜融合;4.膜質小泡內容物減少;5.不規(guī)則的膜質小泡;6.細胞器緊貼質膜;7.高爾基體;8.細胞核內折。

Plate Ⅳ

Fig.1.Vesicles in lumen;

Fig.2.Vesicles releasing content;

Fig.3.The fusion of vesicles with vacuole membrane;

Fig.4.Vesicle which have decreasing content;

Fig.5.Vesicles becoming irrugular;

Fig.6.Close to the plasma membrane organelles;

Fig.7.Showing the golgi apparatus nearing cell wall;

Fig.8.Showing the folded nucleus.

(編輯:潘新社)

Relationship between Ultrastructure and Secretion ofSecretory Canals in Root ofAngelicadahurica

CHEN Ying1,HU Zhenghai2,HU Benxiang1,SHEN Xia1,YAN Yonggang1

(1 College of Pharmacy,Shaanxi-University of Chinese Medicine,Xianyang,Shaanxi 712046,China;2 Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Westen China,Ministry of Education,Northwest Unicersity,Xi’an 710069,China)

The ultrastructure of secretory canals in root ofAngelicadahuricaand the accumulation of essential oils were investigated by transmission electron microscopy (TEM) analysis.The secretion process of the essential oil was also discussed.The results indicate that the plastid,ground substances of cytoplasm and mitochondria took part in the biosynthesis of oil or oil precursor.At latter stages of development of secretory cells,numerous different sized vesicles fused with the plasmalemma and tonoplast and released the inner materia into the lumen of secretory canals.As a result,plastid and ground substances of cytoplasm were the major synthetic site of volatile oil which secreted into the lumen by diffusion or by vesicles fusing with the plasmalemma and tonoplast.Abundant mitochondria may provide energy for the series of process.

Angelicadahurica;development;secretory canal;essential oil;secretion

1000-4025(2015)04-0716-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0716

2014-08-30;修改稿收到日期:2015-01-19

國家自然科學基金(81102758);陜西省自然科學基金(2013JQ4012)

陳 瑩(1981-),女,博士,講師,主要從事藥用植物結構發(fā)育研究。E-mail:chenying029@163.com

Q944.5

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