Treg和淋巴細(xì)胞亞群在急性髓系白血病中的意義

孔令君，葛 健，夏瑞祥

Treg和淋巴細(xì)胞亞群在急性髓系白血病中的意義

孔令君，葛 健，夏瑞祥

摘要目的 研究CD4＋CD25＋CD127low／－調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和淋巴細(xì)胞亞群在急性髓系白血病（AML）患者外周血中的變化、相互關(guān)系及臨床意義。方法 采用流式細(xì)胞儀對(duì)初治組和完全緩解（CR）組外周血Treg及淋巴細(xì)胞亞群水平進(jìn)行檢測(cè)，并與正常對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果 初治組和CR組AML患者外周血中Treg水平均高于正常對(duì)照組（P＜0.05），初治組高于CR組（P＜0.05）。初治組和CR組AML患者外周血的NK（CD3－CD16＋CD56＋）細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例均低于正常對(duì)照組（P＜0.05），初治組低于CR組（P＜0.05）。初治組CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞含量和CD4＋／CD8＋比值均低于正常對(duì)照組（P＜0.05），但初治組CD8＋T細(xì)胞含量卻明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；CR組CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞含量及CD4＋／CD8＋比值接近正常對(duì)照組，與初治組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 AML患者外周血中Treg及CD8＋T細(xì)胞比例明顯升高，NK細(xì)胞、CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞含量和CD4＋／CD8＋比值降低，表明AML患者免疫功能處于抑制狀態(tài)。Treg控制CD8＋T細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)抑制NK細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)，在CD4＋T細(xì)胞與CD8＋T細(xì)胞平衡的失調(diào)中起主要作用，與AML疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過下調(diào)Treg的數(shù)量或去除其抑制功能，優(yōu)化AML患者的免疫治療。

關(guān)鍵詞急性髓系白血??；Treg；淋巴細(xì)胞亞群；NK細(xì)胞；腫瘤免疫

2014－12－30接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230022

急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫水平降低密切相關(guān)，尤其是細(xì)胞免疫異常。近年來，白血病的免疫治療逐漸成為白血病治療中的研究熱點(diǎn)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell， Treg）作為一群獨(dú)特的專職抑制細(xì)胞，主要分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β和白細(xì)胞介素-10等細(xì)胞抑制因子，具有免疫抑制性和免疫無能性，在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持等方面起很重要作用。淋巴細(xì)胞亞群作為機(jī)體抗腫瘤免疫的重要活性細(xì)胞，執(zhí)行細(xì)胞免疫功能，在抗腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。因此，檢測(cè)AML患者Treg、淋巴細(xì)胞亞群，對(duì)于探討AML免疫異常的實(shí)質(zhì)及指導(dǎo)免疫相關(guān)的治療有著重要的意義。該研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化療前后AML患者以及正常對(duì)照者外周血Treg及淋巴細(xì)胞亞群水平，探討其在AML患者化療前后外周血中的變化、相互關(guān)系以及在AML疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床免疫治療AML提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 病例資料 選取2013年4月～2014年9月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科住院的AML患者30例作為實(shí)驗(yàn)組，男14例，女16例；年齡20～74歲，中位年齡47.5歲；診斷符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［1］。AML初治組與完全緩解（CR）組來源于同一患者不同標(biāo)本，其中初治組未治療，CR組為已化療兩個(gè)療程，間隔1個(gè)月未接受化療。健康體檢者30例作為正常對(duì)照組，排除腫瘤與自身免疫性疾病史，男15例，女15例；年齡18～70歲，中位年齡46歲。組與組之間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1．2 實(shí)驗(yàn)器材和試劑 鼠抗人CD25-FITC、CD127-PE、CD4-PC5及同型對(duì)照抗體、CD3-FITC／CD（16＋56＋）-PE、CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5、紅細(xì)胞裂解劑、磷酸鹽緩沖液（PBS）及NAVIOS流式細(xì)胞儀均購自美國COULTER公司。

1．3 方法

1．3．1 標(biāo)本采集 分別采集白血病患者及健康體檢者的晨起空腹外周新鮮靜脈血3 ml，置于EDTA抗凝的真空采血管（去熱源與內(nèi)毒素），輕輕混勻，于2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

1．3．2 CD4＋CD25＋CD127low／－Treg檢測(cè) 取一支FACS專用試管，加入10 μl CD25-PC5、20 μl CD4-FI TC、20 μl CD127-PE；再加入EDTA-K2抗凝的全血

100 μl，渦旋混勻，避光15～20 min。加入1 ml溶血素，充分混勻，避光放置10 min；取出渦旋混勻，1 500 r／min離心5 min，棄上清液。加1 ml PBS混勻，4℃避光1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析應(yīng)用Navios tetra軟件，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，再以CD4和SSC設(shè)門選擇CD4陽性細(xì)胞分析CD4＋CD25high＋CD127low占CD4＋T細(xì)胞的百分率。收集細(xì)胞數(shù)30 000個(gè)／管。

1．3．3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用直接免疫熒光法，取兩支FACS專用試管，各加入100 μl充分混勻的抗凝全血和10 μl CD45-PC5抗體，再分別加入5 μl CD4-FITC／CD8-PE／CD3-PC5抗體和10 μl CD3-FITC／CD（16＋56＋）-PE。渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min。加入1 ml溶血素，充分混勻，避光放置10 min，觀察待測(cè)樣本裂解后呈均一透明紅色，管底無紅細(xì)胞沉淀。取出渦旋混勻，1 500 r／min，離心5 min，棄上清液。加1 ml PBS混勻，30 min內(nèi)上機(jī)，用NAVIOS流式細(xì)胞儀分析系統(tǒng)軟件獲取30 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 CD4＋CD25＋CD127low／－Treg占CD4＋T細(xì)胞檢測(cè)率 初治組、CR組和正常對(duì)照組Treg檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示檢測(cè)率滿足方差齊性，3組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝43.67，P＜0.05）。3組間均數(shù)兩兩比較結(jié)果示：初治組（10.16±3.61）明顯高于CR組（8.53±2.97）和正常對(duì)照組（6.45± 1.84），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CR組明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2．2 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)率 初治組、CR組和正常對(duì)照組淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：①NK細(xì)胞（CD16＋56＋）：檢測(cè)率滿足方差齊性，3組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝71.39，P＜0.05）。3組間均數(shù)兩兩比較結(jié)果示，初治組和CR組均低于正常對(duì)照組（P＜0.05），初治組低于CR組（P＜0.05）。②CD8＋T細(xì)胞：檢測(cè)率滿足方差齊性，3組均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝13.69，P＜0.05）。3組間均數(shù)兩兩比較結(jié)果示，初治組均高于CR組和正常對(duì)照組（P＜0.05），CR組和正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞、CD4＋／CD8＋：檢測(cè)率均滿足方差齊性，3組均數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝22.57、19.26、33.86，P＜0.05）。3組間均數(shù)兩兩比較結(jié)果示，初治組均顯著低于CR組和正常對(duì)照組（P＜0.05），但CR組和正常對(duì)照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1　各組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1　各組外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果（±s）

與正常對(duì)照組比較：*P＜0.05；與初治組比較：＃P＜0.05

項(xiàng)目　　初治組　CR 組　　正常對(duì)照組CD3＋　66．06±8．47*　73．08±8．34＃72．91±7．88 CD4＋　32．08±8．80*　38．88±8．70?！?9．02±8．21 CD8＋　33．75±6．51*　30．76±5．74＃　30．66±6．12 CD4＋／CD8＋　0．95±0．19*　1．29±0．34＃　1．31±0．24 CD16＋56＋　4．77±1．95*　7．29±1．97*＃14．26±4．76

3 討論

Treg作為一類具有免疫負(fù)調(diào)控作用的T細(xì)胞，在腫瘤免疫和移植免疫中起重要作用。Treg在霍奇

金病患者腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中及胃癌、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體腫瘤患者的外周血中明顯增加［2－3］。該研究通過檢測(cè)30例初治AML患者及其化療達(dá)CR外周血Treg數(shù)量，并與正常對(duì)照者進(jìn)行對(duì)比，表明初治組AML患者外周血Treg水平明顯高于CR組和正常對(duì)照組，且CR組高于正常對(duì)照組。這提示升高Treg能抑制細(xì)胞的正常免疫功能，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)AML的疾病發(fā)生發(fā)展。研究［4］顯示，化療達(dá)CR的AML患者體內(nèi)恢復(fù)的多數(shù)為Treg，這表明達(dá)CR的AML患者體內(nèi)Treg含量仍維持著較高水平，與該研究結(jié)果一致。高水平的Treg的免疫抑制作用，使達(dá)CR的AML患者體內(nèi)白血病細(xì)胞不能被完全清除，促使AML的復(fù)發(fā)。

Ustun et al［5］發(fā)現(xiàn)，AML患者體內(nèi)表達(dá)吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）能使CD4＋CD25－T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4＋CD25＋T細(xì)胞，Treg含量明顯增多。在建立動(dòng)物模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［6］中發(fā)現(xiàn)，這一過程可被IDO的特異性抑制劑1-甲基色氨酸所逆轉(zhuǎn)，1-甲基色氨酸還具有增強(qiáng)腫瘤化療藥物療效的作用?？紤]可以通過IDO的特異性抑制劑靶向治療等方法降低體內(nèi)的Treg含量，為臨床設(shè)計(jì)有效的抗腫瘤治療方案提供新的思路。

淋巴細(xì)胞亞群在腫瘤免疫中起中心調(diào)控作用，執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)功能和細(xì)胞免疫功能。本研究結(jié)果顯示初治AML患者外周血CD3＋T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞及CD4＋／CD8＋比值較正常對(duì)照組均明顯降低，初治組CD8＋T細(xì)胞明顯高于正常對(duì)照組；初治組及CR組NK細(xì)胞水平均明顯低于正常對(duì)照組，而初治組低于CR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明AML患者免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，且Treg優(yōu)勢(shì)狀態(tài)與NK細(xì)胞抑制狀態(tài)具有一致性。研究［7］顯示，Treg在機(jī)體免疫的初始階段促進(jìn)CD8＋T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，之后限制CD8＋T細(xì)胞活性，而CD4＋／CD8＋只有在穩(wěn)定比例的前提下才能維持細(xì)胞免疫反應(yīng)的平衡。這說明Treg在CD4＋T細(xì)胞與CD8＋T細(xì)胞平衡的失調(diào)中起控制作用。吳澤霖等［8］發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者體內(nèi)Treg細(xì)胞膜表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長因子-β直接抑制NK細(xì)胞的功能，并下調(diào)NK細(xì)胞表面受體NKG2D，從而抑制NK細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)。這說明Treg可能也對(duì)NK細(xì)胞起到同樣的調(diào)節(jié)作用，影響其對(duì)腫瘤細(xì)胞的廣譜殺傷作用，從而最終導(dǎo)致了白血病細(xì)胞的持續(xù)增長。

綜上所述，Treg和淋巴細(xì)胞亞群相互影響，促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的紊亂，最終導(dǎo)致AML的產(chǎn)生和發(fā)展。由于目前治療AML主要依靠化療和骨髓移植，治療過程中常出現(xiàn)嚴(yán)重的機(jī)體損傷，治療費(fèi)用昂貴?？紤]可以降低Treg的數(shù)量去除Treg的功能，為臨床治療AML設(shè)計(jì)有效的免疫治療方案。

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The significance of Treg and T lymphocyte subsets in acute myelocytic leukemia

Kong Lingjun，Ge Jian，Xia Ruixiang
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

AbstractObjective To explore the alterations，relationship and clinical significance of CD4＋CD25＋CD127low／－

regulatory T cells（Treg）and lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with acute myelocytic leukemia （AML）．Methods The level of peripheral blood lymphocyte subsets and Treg of untreated AML patients and complete remission（CR）patients were tested by flow cytometry，and were compared with that of 30 normal controls．Results The proportions of Treg were much higher in untreated AML patients and CR patients than in normal controls，while the mean proportion of Treg in untreated AML patients was higher than that in CR patients（P＜0.05）．The proportions of NK（CD3－CD16＋CD56＋）cells in untreated AML patients and CR patients were both decreased compared with normal controls，and the mean proportion of NK cells in untreated AML patients was lower than that in CR patients（P＜0.05）．Compared with the normal controls，the proportions of CD3＋T cell，CD4＋T cell，and the ratio of CD4＋／CD8＋decreased in untreated AML patients（P＜0.05），but the proportions of CD8＋T cell was higher than in normal controls；the proportions of CD3＋T cell，CD4＋T cell，CD8＋T cell and the ratio of CD4＋／CD8＋in CR patients were close to the proportions in normal controls，but there was significant difference between CR patients and untreated AML patients（P＜0.05）．Conclusion The increase of Treg，CD8＋T cell and decrease of NK cells，CD3＋T cell，CD4＋T cell，and the ratio of CD4＋／CD8＋in peripheral blood of patients with AML indicate that the immune function of patients with AML is depressed．Treg control the immune response of CD8＋T cells，at the same time inhibit the natural immune response of NK cells，playing a major role in the disorders of CD4＋T cells and CD8＋T cell balance，and closely relate with the development of AML．The immune treatment of patients with AML will be optimised by reducing the amount of Treg or removing the suppression function．

Key wordsacute myelocytic leukemia；Treg；lymphocyte subsets；NK cells；tumor immunity

作者簡介：孔令君，女，碩士研究生；葛 健，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：gejian77＠m(xù)edmail．com．cn；夏瑞祥，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：xrx2041＠163．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81200371）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題（新教師類聯(lián)合資助課題）（編號(hào)：20123420120011）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085QH154）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0512－04

中圖分類號(hào)R 733．71