貫葉連翹提取物對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷的保護(hù)作用

程啟閏，方海明，李芳群，宋莎莎，章禮久

貫葉連翹提取物對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷的保護(hù)作用

程啟閏，方海明，李芳群，宋莎莎，章禮久

摘要目的 探討貫葉連翹提取物（HPL）對(duì)刀豆蛋白A （ConA）誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷的保護(hù)作用。方法60只ICR小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、HPL低劑量組（25 mg／kg）、HPL中劑量組（50 mg／kg）、HPL高劑量組（100 mg／kg）和地塞米松組（2.5 mg／kg）。灌胃給予小鼠不同劑量HPL10 d后，采用尾靜脈注射ConA 20 mg／kg制備急性免疫性肝損傷模型。8～12 h后稱重，處死小鼠，檢測(cè)肝脾指數(shù)；檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）活性和膽紅素、球蛋白含量；檢測(cè)肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）和Toll樣受體4（TLR4）含量；光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果 與模型組比較，HPL顯著降低小鼠肝脾指數(shù)、血清中ALT、AST、γ-GT活性和膽紅素、球蛋白含量；降低肝組織中MDA含量和TLR4表達(dá)，提高SOD活性；減輕肝組織病理損傷程度。結(jié)論 HPL對(duì)小鼠急性免疫性肝損傷有明顯的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞貫葉連翹提取物；小鼠；急性免疫性肝損傷；脂質(zhì)過氧化；Toll樣受體4

2015－01－05接收

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230601

我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，乙肝表面抗原攜帶者約有1．2億［1］，大部分乙肝患者可進(jìn)一步發(fā)展成肝纖維化、肝硬化，其中少部分可轉(zhuǎn)為肝癌［2］。肝細(xì)胞損害主要取決于機(jī)體的免疫應(yīng)答，肝外損傷主要由免疫復(fù)合物引起，因此免疫反應(yīng)在肝炎的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。目前臨床應(yīng)用的治療肝病的藥物種類并不多，中醫(yī)中藥在治療乙肝方面取得了一定的進(jìn)展，但尚未見重大突破。貫葉連翹提取物（Hypericum Perforatum．L，HPL）為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，在歐美等國用于治療抑郁癥已有上百年歷史［3］，具有抗抑郁、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用［4－9］。此外，有研究［10］表明HPL含活性成分原花青素，有明顯的抗氧化作用。肝臟的炎癥、氧化反應(yīng)可引起肝損傷。該研究擬采用刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）建立小鼠急性免疫性肝損傷模型，初步探討HPL對(duì)肝損傷的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠60只，SPF級(jí)，雄性，18 ～22 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．2 藥物與試劑 HPL購自天津馬克生物技術(shù)公司，批號(hào)：20130225；地塞米松購自金陵藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20130422；ConA購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）、膽紅素、球蛋白、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1．3 儀器 電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠意成公司）；SPectraMax 190全波長酶標(biāo)儀（美國MD公司）；1．0型高速低溫離心機(jī)、分光光度儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16H高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；Nikon ECLIPSE 80i光學(xué)顯微鏡（尼康映像儀器銷售中國有限公司）；RXL全自動(dòng)生化儀（西門子有限公司）。

1．4 造模及給藥 60只ICR小鼠隨機(jī)均為正常組、模型組、HPL低劑量組（25 mg／kg）、HPL中劑量組（50 mg／kg）、HPL高劑量組（100 mg／kg）和地塞米松組（2．5 mg／kg）。給藥組小鼠每天灌胃給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組分別給予等體積生理鹽水，1次／d，連續(xù)10 d。末次給藥后除正常組，各組小鼠尾靜脈注射ConA（20 mg／kg）一次性建立急性免疫性肝損傷模型，正常組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1．5 樣本制備和檢測(cè)

1．5．1 檢測(cè)肝脾指數(shù) 造模后，各組小鼠禁食不禁飲，8 h后稱重，頸椎脫臼處死小鼠，剝離肝臟和脾臟，分別稱重。肝臟指數(shù)（%）＝肝重／小鼠體重× 100%，脾臟指數(shù)（%）＝脾重／小鼠體重×100%。

1．5．2 檢測(cè)血清中ALT、AST、γ-GT活性和膽紅素、球蛋白含量 小鼠用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)眼球取血，4℃下4 000 r／min離心10 min，收集上層血清，按照試劑盒標(biāo)注的方法測(cè)定血清中ALT、AST、γ-GT活性和膽紅素、球蛋白含量。

1．5．3 肝組織中MDA和SOD含量的測(cè)定 取小鼠肝右葉稱重，洗凈后加4℃預(yù)冷生理鹽水于勻漿器中研磨，冰浴中制備10%勻漿，3 000 r／min離心15 min，取上清液，按試劑盒說明測(cè)定肝臟勻漿中MDA和SOD含量。

1．5．4 肝臟病理組織學(xué)觀察 取小鼠肝左葉同一部位組織，PBS沖洗干凈，按照常規(guī)方法，10%甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肝組織形態(tài)并攝片。

1．5．5 免疫組化法檢測(cè)肝組織中TLR4表達(dá) 肝組織切片脫蠟水化后微波法進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%H2O2，37℃孵育10 min，PBS洗滌3次后封閉，37℃孵育30 min，滴加一抗，4℃冰箱過夜；37℃復(fù)溫，滴加鼠兔通用型二抗，室溫孵育20 min；PBS充分洗滌3次后加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫放置15 min；PBS沖洗后DAB顯色，流水沖洗，蘇木精復(fù)染、沖洗、泛藍(lán)、烘干10 min；二甲苯透明5 min，中型樹膠封片；光學(xué)顯微鏡下觀察TLR4表達(dá)。再采用Image-Pro Plus 6．0圖像分析軟件對(duì)各免疫組化圖片進(jìn)行平均光密度檢測(cè)和分析。以參數(shù)平均光密度代表TLR4蛋白的顆粒密度。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，定量資料以±s表示；符合正態(tài)分布且方差齊性的資料采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響 模型組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)較正常組均明顯升高（P＜0.01），提示造模成功。HPL低、中、高劑量組和地塞米松組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1　HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的影響（±s，n＝8）

表1　HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝脾指數(shù)的影響（±s，n＝8）

與正常組比較：＃＃P＜0．01；與模型組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　　肝臟指數(shù)（%）　　脾臟指數(shù)（%）正常5．39±0．26　0．35±0．05模型　6．79±0．47＃＃　0．65±0．10＃＃HPL低劑量　6．15±0．59*　0．53±0．04*HPL中劑量　6．04±0．35**　0．51±0．02**HPL高劑量　5．71±0．21**　0．50±0．04**地塞米松　5．43±0．46**　0．43±0．05**

2．2 HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝功能的影響

模型組小鼠血清ALT、AST、γ-GT、球蛋白、膽紅素水平較正常組均顯著升高（P＜0.01），提示造模成功。HPL低、中、高劑量組和地塞米松組ALT、AST、γ-GT、球蛋白、膽紅素水平均明顯低于模型組（P＜0．05，P＜0.01），見表2。

表2　HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝功能的影響（±s）

表2　HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝功能的影響（±s）

與模型組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與正常組比較：＃＃P＜0．01

組別　　球蛋白（g／L）　ALT（U／L）　AST（U／L）　　γ-GT（U／L）　　膽紅素（μmol／L）正常　32．97±4．65　18．20±3．70　75．20±13．10　2．80±1．302．04±0．96模型　42．82±2．43＃?！?7．60±6．99＃?！?37．00±15．64＃＃　7．40±1．14＃?！?．62±1．80＃＃HPL低劑量　38．77±2．51　22．40±4．39*　91．40±23．15*　4．80±1．10*　3．66±1．35*HPL中劑量　39．85±1．79*　21．00±3．16**　83．00±16．54*　4．60±1．14*　3．40±1．55**HPL高劑量　37．87±4．97*　19．40±2．07**　85．40±11．61**　4．40±1．34*　2．36±0．81**地塞米松　33．20±3．14**　18．40±7．16**　85．40±8．85**　3．00±1．58*　2．18±0．86**

2．3 HPL對(duì)肝損傷小鼠肝組織中SOD和MDA水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，HPL各劑量組和地塞米松組MDA含量降低，SOD活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），其中中劑量組、高劑量組HPL作用較顯著（P＜0.01），見圖1。

2．4 HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝臟病理組織學(xué)變化的影響 HE染色后，光鏡下可見正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列。模型組肝索排列紊亂，大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹、胞質(zhì)疏松，伴有灶狀和大片細(xì)胞壞

死、炎細(xì)胞浸潤，提示造模成功。HPL各劑量組肝索基本呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰，部分細(xì)胞腫脹，可見少量細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤，與模型組比較有顯著改善。見圖2。

2．5 HPL對(duì)急性免疫性肝損傷小鼠肝組織中TLR4表達(dá)的影響 光鏡下可見TLR4蛋白陽性顆粒定位在肝細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜，呈棕黃色。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中TLR4表達(dá)呈強(qiáng)陽性，其平均光密度明顯高于正常組（P＜0.01）。HPL各劑量組小鼠陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，其表達(dá)量（平均光密度）低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），見圖3、表3。

表3　小鼠肝組織TLR4表達(dá)情況（±s，n＝8）

表3　小鼠肝組織TLR4表達(dá)情況（±s，n＝8）

與正常組比較：＃＃P＜0．01；與模型組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

組別　　平均光密度正常0．225 1±0．032 3模型　0．339 2±0．015 2＃＃HPL低劑量　0．282 3±0．030 3**HPL中劑量　0．271 2±0．042 9*HPL高劑量　0．259 3±0．024 5**地塞米松　0．230 4±0．031 7**

3 討論

ConA是一種可活化T細(xì)胞的有絲分裂原，其誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷與人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等病理生理過程十分相似［11］。其致病機(jī)理是ConA經(jīng)尾靜脈注射入血后誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，異常活化的T細(xì)胞先于脾臟再到肝臟介導(dǎo)過度免疫應(yīng)答，從而引起脾臟、肝臟腫大［12］，因此肝脾指數(shù)可間接反應(yīng)肝臟受損程度。本研究結(jié)果顯示HPL可顯著降低ConA所致增加的肝脾指數(shù)，提示HPL能有效抑制肝臟、脾臟免疫反應(yīng)，減輕肝細(xì)胞損傷程度。

球蛋白由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)作用。當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，人體的免疫系統(tǒng)就會(huì)隨之被激活，導(dǎo)致球蛋白含量增加。同時(shí)，受損的肝細(xì)胞由于細(xì)胞膜通透性、完整性改變，釋放一些酶進(jìn)入血液，如ALT、AST。γ-GT廣泛分布于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管一側(cè)和整個(gè)膽管系統(tǒng)，肝細(xì)胞損害、腫脹時(shí)，肝內(nèi)膽管受壓，膽汁排出受阻，血中γ-GT水平增高。此外，肝細(xì)胞能攝取血中衰老紅細(xì)胞分解產(chǎn)生的未結(jié)合膽紅素，與葡萄糖醛酸結(jié)合轉(zhuǎn)化為結(jié)合膽紅素，在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)與膽汁酸鹽等一起隨膽汁排出。肝細(xì)胞受損時(shí)對(duì)膽紅素?cái)z取、結(jié)合、排泄障礙均可導(dǎo)致血清中膽紅素升高。因此，血清ALT、AST、γ-GT、膽紅素、球蛋白水平在一定程度上反應(yīng)了肝細(xì)胞損傷程度。本研究結(jié)果表明，HPL可顯著降低血清ALT、AST、γ-GT、球蛋白及膽紅素的升高水平，提示HPL可減輕肝細(xì)胞損傷程度。病理結(jié)果同樣顯示，HPL組小鼠肝組織損傷程度明顯減輕。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死，其含量高低可間接反應(yīng)肝細(xì)胞過氧化后損傷的程度。SOD是一種能催化超氧化物的酶，可抑制自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，其活力高低亦可作為衡量肝損傷程度的指標(biāo)，呈負(fù)相關(guān)性。HPL含有某些抗氧化成分如黃酮類、原花青素等，可以清除自由基、保護(hù)細(xì)胞不受損傷，從而維持機(jī)體良好的生理功能狀態(tài)［5，7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組MDA含量較正常組明顯升高，SOD活性降低。HPL處理后，MDA含量降低，SOD活性升高，提示HPL可通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。

在致炎因子的作用下，TLR4識(shí)別相應(yīng)配體，通過MyD88依賴或非依賴途徑激活下游信號(hào)通路，最后活化核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、干擾素調(diào)控因子-3 （IRF-3）等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答［13］。有研究［14］表明，TLR4 siRNA預(yù)處理后可以控制炎癥反應(yīng)，明顯減輕小鼠肝損害，降低死亡率。本研究中模型組小鼠肝臟組織鏡下可見肝細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞浸潤，TLR4表達(dá)增加。預(yù)防給藥HPL后，肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯減輕，TLR4表達(dá)與模型組相比明顯下降。提示，HPL可能通過抑制肝組織中TLR4表達(dá)減少肝臟炎癥反應(yīng)，從而減輕肝臟損傷程度。

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The protective effect of Hypericum Perforatum．L on acute immunological liver injury in mice

Cheng Qirun，F(xiàn)ang Haiming，Li Fangqun，et al
（Dept of Gastroenterology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

AbstractObjective To investigate the protective effect of Hypericum Perforatum．L（HPL）on concanavalin A （Con A）-induced acute immunological liver injury in mice．Methods Sixty ICR mice were randomly divided into six groups：normal group，model group，HPL（25，50，100 mg／kg）groups and positive control group（dexamethasone，2．5 mg／kg）．The model of mice acute immunological liver injury was induced by tail intravenous injecting with ConA（20 mg／kg）on day 10 after treatment with different concentrations of HPL．After 8 to 12 h，mice were weighed and sacrificed．The liver and spleen index were calculated，the level of ALT，AST，γ-GT，TBIL，GLB in serum and SOD，MDA，TLR4 in liver tissues were tested．Additionally，the hepatic pathological changes were observed．Results Compared with model group，the liver and spleen index，the level of ALT，AST，γ-GT，TBIL，GLB in serum and the content of MDA and TLR4 in liver tissue were decreased，the SOD activity was increased in HPL groups．Moreover，the hepatic pathological injury was obviously alleviated after treatment with HPL．Conclusion HPL has obviously protective effects on acute immunological liver injury mice，which might be associated with its ability of decreasing TLR4 expression in liver tissue．

Key wordsHypericum Perforatum．L；mice；acute immunological liver injury；lipid peroxidation；Toll like receptor 4

作者簡介：程啟閏，女，碩士研究生；方海明，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：haimingfang＠163．com；章禮久，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhanglijiu6336＠163．com

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085MH178）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0477－05

中圖分類號(hào)R 285．5