隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

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科學(xué)研究

隆林山羊ACSS2基因的克隆及序列分析

曹艷紅1，周恒1*，朱江江2，3，史懷平3，莫柳忠1，張彩珠1

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所,廣西家畜遺傳改良重點實驗室， 廣西 南寧530001；2.西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用實驗室，四川 成都 610041；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室，陜西 楊凌712100)

[摘要]根據(jù)藏系綿羊的ACSS2基因序列設(shè)計克隆引物，并以隆林山羊肌間脂肪組織為模板克隆ACSS2基因并測序。利用在線生物信息學(xué)軟件分析ACSS2蛋白的序列特性，分析不同物種間ACSS2基因的進(jìn)化關(guān)系及三級結(jié)構(gòu)，從而預(yù)測隆林山羊ACSS2基因的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隆林山羊ACSS2基因CDS全長 2 103 bp，由18個外顯子組成，編碼701個氨基酸殘基。與牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、綿羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)序列的ACSS2基因相比較，核苷酸相似性分別為97.9%、91.5%、97.6%和88.2%，氨基酸的相似度分別為98.4%、93.6%、97.4%和91.9%。其中綿羊較山羊多出13個氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2蛋白與其他物種間具有相似的三級結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，且與綿羊和牛具有較近的親緣關(guān)系，而與豬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

[關(guān)鍵詞]隆林山羊; ACSS2；肌間脂肪；

隨著人們生活水平的提高，富含高蛋白、低膽固醇的羊肉備受人們青睞。羊肉中含有多種不飽和脂肪酸，具有獨特的營養(yǎng)保健功能，能夠降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平[1]，可以明顯降低高脂血癥患者的血脂水平等[2]。通過改變羊肉中脂肪酸組成，以此來改善羊奶風(fēng)味和營養(yǎng)價值是現(xiàn)在肉羊育種的重要手段，然而現(xiàn)在關(guān)于羊肉中脂肪酸合成的分子機制還不是很清楚。

脂肪酸的從頭合成是動物體內(nèi)脂肪酸的重要來源[3]，乙酰輔酶A羧化酶和脂肪酸合酶催化了從乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A為底物的全過程，從而形成長鏈脂肪酸[4-5]。而其中乙酰輔酶A則是由乙酰輔酶A合成酶催化乙酸而形成[6]，從而用于脂肪酸的合成。乙酰輔酶A 合成酶(acetyl-Coenzyme A synthetase, ACAS)是乙酰輔酶A 中短鏈家族的成員之一。 編碼乙酰輔酶A 合成酶的基因有兩個，即ACSS1和ACSS2[7]。ACSS2 基因的表達(dá)由固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)調(diào)節(jié), 而SREBP在脂肪代謝及膽固醇合成過程中起著重要作用[8-10]。因此, Lerez 認(rèn)為ACSS2 基因有可能影響動物的生長和脂質(zhì)性狀[10]。Zachary等[11]發(fā)現(xiàn)，ACSS2能夠促進(jìn)細(xì)胞對乙酸的利用，并對維持癌細(xì)胞的生長提供了脂質(zhì)底物。Chen等[12-13]發(fā)現(xiàn)，ACSS2通過調(diào)控HIF-2信號通路從而影響腫瘤細(xì)胞的胞內(nèi)微環(huán)境。Bionaz等[14]發(fā)現(xiàn)，ACSS2在牛初乳、常乳和末乳中均有表達(dá)。與初乳相比, 常乳和末乳中ACSS2表達(dá)顯著降低?？梢?，ACSS2在細(xì)胞脂質(zhì)形成和脂代謝調(diào)控過程中具有重要作用。陳志成等[15]通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)得到了藏系綿羊ACSS2基因的cDNA序列。然而，現(xiàn)在還沒有關(guān)于隆林山羊ACSS2基因序列及功能研究的報道。本研究采集隆林山羊肌間脂肪組織，并通過克隆ACSS2基因序列并進(jìn)行序列分析，為進(jìn)一步在山羊肌間脂肪酸細(xì)胞中研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　試驗材料

采集廣西畜牧研究所養(yǎng)羊研究室的2~3 歲、健康的3只隆林山羊為研究對象。屠宰后，迅速采集肌間脂肪組織，用DEPC水洗凈后分裝，迅速放入液氮罐中保存，用干冰運送至西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點實驗室用于后續(xù)研究。DNA 片段快速回收試劑盒、 病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒和高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、大腸桿菌 TOP10均購自北京天根生化科技有限公司；實時定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ)和第一鏈 cDNA 合成試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent Kit)均購自大連 TaKaRa 公司；LA Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ均購自大連TaKaRa 公司；pMD-T 載體購自大連TaKaRa 公司。

1.2　試驗方法

1.2.1引物設(shè)計根據(jù)報道的藏系山羊的ACSS2基因序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計特異性克隆引物：PCR 引物采用 Primer Premier 5.0，克隆引物在 5′端分別引入XhoⅠ和EcoRⅤ酶切位點(劃線部分)。上游引物TGCCTCGAGAGCCACC ATGGGACTTCCCGAAGAGCGGA, 下游引物CCGGATATCC TTGGATGGTCAAGCAGCG。

1.2.2RNA提取與cDNA合成利用Trizol一步法提取隆林山羊肌間脂肪組織總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測RNA完整性，-80 ℃長期保存。第一鏈cDNA的合成按照Takara公司第一鏈cDNA合成試劑盒說明書操作。

1.2.3ACSS2基因的CDS區(qū)的克隆以隆林山羊肌間脂肪cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增。其反應(yīng)體系為：10×LA Buffer II(含Mg2+) 2 μL， dNTPs(2.5 μmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL， LA Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，每個循環(huán)增加1 ℃,25個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。

擴增產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA快速回收試劑盒回收目的片度，并于16 ℃連接pMD-19-T載體；次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于含有24 μg/mL X-gal及100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)皿表面，37 ℃ 培養(yǎng)12~16 h左右；挑取單個白色陽性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定，將含陽性重組質(zhì)粒的菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.2.4序列分析利用NCBI中的blastn和blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對測序得到的ACSS2基因序列進(jìn)行同源性分析；通過BioXM 2.6軟件對ACSS2的氨基酸序列進(jìn)行物種間多序列比對；利用Splign進(jìn)行外顯子預(yù)測(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage=online&level=form)；利用Phyre2 進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)[16]。利用MEGA5進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

2結(jié)果與分析

2.1　ACSS2基因的克隆

以總RNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到2 200 bp左右的擴增產(chǎn)物，與預(yù)期長度相符(圖1)，并對提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定；測序結(jié)果顯示，得到山羊ACSS2基因片段2 159 bp，其中CDS區(qū)全長2 103 bp，編碼701個氨基酸殘基，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。隆林山羊ACSS2基因與牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、綿羊(XM_012114899)、小鼠序列(NM_019811)的ACSS2基因相比較，核苷酸相似性分別為97.9%、91.5%、97.6%和88.2%，氨基酸的相似度分別為98.4%、93.6%、97.4%和91.9% (圖2)。其中綿羊較山羊多出13個氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)。

圖1　隆林山羊ACSS2基因的PCR擴增

圖2　不同物種間ACSS2蛋白序列比對

2.2　ACSS2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了探求ACSS2基因在不同物種間的親緣關(guān)系，根據(jù)已經(jīng)報道的不同物種的氨基酸序列進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，包括牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、綿羊(XM_012114899)、小鼠(NM_019811)、猩猩(XM_009437081 、XM_004062044)、豬(NM_001143695)、猴子(NM_001265800)和大鼠(NM_001107793)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山羊ACSS2與綿羊的親緣關(guān)系最近，牛次之。反芻動物與靈長類(人、猩猩、猴子)和鼠類(大鼠和小鼠)具有較近的親緣關(guān)系，而與豬的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖3)。

圖3　ACSS2蛋白的生物進(jìn)化樹分析

2.3　ACSS2蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析

利用Splign軟件對ACSS2進(jìn)行外顯子預(yù)測(利用牛的基因組作為參考)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACSS2處于13號染色體上，其CDS區(qū)由18個外顯子區(qū)域構(gòu)成[17]。同時利用Phyre2對牛(NM_001105339)、人(NM_018677)、綿羊(XM_012114899)和隆林山羊的蛋白三維機構(gòu)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)山羊ACSS2與在不同的物種間具有相似的三級結(jié)構(gòu)。推測山羊ACSS2和人、牛、綿羊的ACSS2具有相似的功能。

圖4　ACSS2蛋白基因外顯子分析(A)及

3討論

ACSS2基因是動物體內(nèi)乙酰輔酶A的主要來源，可以催化從外源攝取和糖代謝所產(chǎn)生的乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴］o酶A[18]，從而被脂肪酸合成所利用[11]。所以ACSS2在連接糖代謝和脂代謝的過程中具有重要作用?，F(xiàn)在對于ACSS2的功能研究主要集中在人和小鼠中。Sarah等[19-21]表明ACSS2能夠通過利用乙酸鹽從而為人類腫瘤的生長提供碳的來源。Stuart等[22]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的ACSS蛋白能夠通過將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A來引起免疫相關(guān)基因的組氨酸乙?；瘡亩饘τ诩毙跃凭愿窝椎拿庖叻磻?yīng)。而在反芻動物中，Poonam等[23]發(fā)現(xiàn)ACSS2的表達(dá)與水牛乳產(chǎn)量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而與乳脂含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。然而現(xiàn)在還沒有關(guān)于山羊ACSS2功能的研究，本研究通過基因克隆等方法得到山羊ACSS2基因的序列，這些結(jié)果將為后續(xù)的功能研究提供參考。

隆林山羊是廣西地區(qū)特有的山羊品種，具有生長快、發(fā)育快、體格碩大、繁殖率高、肉質(zhì)好、適應(yīng)性強、飼養(yǎng)成本低、屠宰率高等優(yōu)點[24]，解析隆林山羊肌間脂肪脂肪酸的形成機制，改善山羊肉質(zhì)是廣西地區(qū)山羊育種的重要組成部分。然而現(xiàn)在關(guān)于隆林山羊ACSS2基因的序列和功能研究較少。陳志成等利用轉(zhuǎn)錄組測序的方法報道了藏系綿羊ACSS2基因的序列，然而由于不同的山羊品種間的差異，藏系綿羊的基因序列僅為隆林山羊的基因功能研究提供參考，但并不能作為最終的序列信息來使用。本試驗中首次已以RT-PCR的方式克隆得到了隆林山羊ACSS2基因的CDS區(qū)，全長2 103 bp編碼701個氨基酸殘基，這與藏系綿羊的結(jié)果一致[15]。然而，本試驗所得到的結(jié)果與藏系綿羊仍然有5個氨基酸的差異，說明在不同的羊品種間，其氨基酸序列并不完全一致。而這種差異是否會造成其功能上的差異還需要更進(jìn)一步的驗證。

山羊與綿羊雖然有著不同的染色體數(shù)目，但是卻有著較近的親緣關(guān)系。本研究中通過對ACSS2基因序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)隆林山羊與綿羊具有最近的親緣關(guān)系，其次為同為反芻動物的牛，這與之前的研究結(jié)果一致[16，25]。而靈長類動人和猩猩，咧齒類動物的小鼠和大鼠為同一種屬也證明了本結(jié)果的可靠性。

本研究發(fā)現(xiàn)，ACSS2基因在不同物種間有較高的相似性，然而綿羊ACSS2基因與山羊等其他物種相比較多出13個氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)，但這種差異并沒有造成蛋白三級結(jié)構(gòu)的改變。雖然綿羊ACSS2蛋白與其他物種間的差異還需要更進(jìn)一步的驗證，而相似的三級結(jié)構(gòu)也暗示ACSS2在不同物種間可能具有相似的功能。

4結(jié)論

隆林山羊肌間脂肪ACSS2基因CDS區(qū)序列,全長2 013 bp，編碼701個氨基酸殘基。綿羊ACSS2基因與山羊等其他物種相比較多出13個氨基酸(G279-Q291，GKPKEKPKHIRPQ)。隆林山羊ACSS2基因與綿羊具有最近的親緣關(guān)系，牛次之，與豬的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

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Cloning and Sequence Analysis ofACSS2 Gene in Longlin Goat

CAO Yan-hong1, ZHOU Heng1*, ZHU Jiang-jiang2，3, SHI Huai-ping3,MO Liu-zhong1, ZHANG Cai-zhu1

(1.AnimalHusbandryInstituteofGuangxiZhuangAutonomousRegion,Nanning，Guangxi530005,China;

2.KeyLaboratoryofSichuanProvinceforQinghai-TibetanPlateauAnimalGeneticReservationandExploitationin

SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041，China;

3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity/ShaanxiProvincialKeyLaboratoryof

MolecularBiologyforAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:The primers were designed according to the ACSS2 sequence of Tibetan sheep, CDS of ACSS2 was cloned and sequenced by RT-PCR. Using online tools, the sequence character, structure prediction and evolution analysis were performed, which may be helpful for the function prediction of ACSS2 in Longlin goat. The results showed that the coding region of ACSS2 of Longlin goat is 2 103 bp, comprised of 18 exons, coding 701 amino acids. The similarity of RNA sequence and protein sequence between Longlin goat and bovine, human, sheep, mouse are 97.9%, 91.5%, 97.6%, 88.2% and 98.4%, 93.6%, 97.4% and 91.9% respectively. The protein sequence of sheep ACSS2 is longer than other species including goat et al by 13 amino acids. The tertiary structure of goat showed high similarity with bovine, human and mouse, and has close genetic relationship with ovis and bovine, but a far distance with pig.

Key words:Longlin goat; ACSS2; intramuscular fat

[中圖分類號]S811.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1005-5228(2015)11-0012-05

*[通訊作者]周恒(1975-)，男，廣西桂林人，助理研究員，本科，研究方向為山羊的遺傳育種。E-mail：zhouheng9@Sohu.com

[作者簡介]曹艷紅(1983-)，女，山西靈石人，畜牧師，碩士，研究方向為山羊的遺傳育種改良。E-mail：caoyh610@163.com

[基金項目]廣西家畜遺傳改良重點實驗室開放課題(2014GXKLLGI-10)

*[收稿日期]2015-06-03修回日期：2015-07-02