外源性導入肝細胞生長因子對人肺腺癌A549 細胞增殖、黏附、移動和侵襲的影響

高 霞，李 恒，韓 笑，陳洪雷

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 病理科，湖北 武漢，430015;2.湖北省婦幼保健院 小兒心血管內(nèi)科，湖北 武漢，430070;3.武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 病理學教研室，湖北 武漢 430071)

肺癌是嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤之一，這其中絕大多數(shù)為非小細胞肺癌(NSCLC)。NSCLC 的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，與細胞因子、癌基因等均關(guān)系密切。研究認為肝細胞生長因子(HGF)引導的信號通路(HGF/c-Met 信號通路)在NSCLC 的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用［1］。c-Met 是原癌基因c-Met 編碼的一種酪氨酸激酶受體，其配體是HGF。HGF/c-Met 信號通路的部分功能可能與黏附分子有關(guān)聯(lián)。本研究探討HGF 對人肺腺癌A549 細胞增殖、黏附、移動和侵襲能力的影響及其對c-Met 和E-cad 蛋白表達的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑

人肺癌細胞系A(chǔ)549，引自美國保藏中心(ATCC)。c-Met 多克隆抗體(濃縮型，工作濃度為1 ︰80)為Santa Cruz 公司產(chǎn)品;鼠抗人E-cad單克隆抗體(即用型)、免疫組化PV-9000 即用型試劑盒以及DAB 染色試劑購自福州邁新。采用日本Olympus BX53 顯微鏡系統(tǒng)進行成像和定量分析。人重組肝細胞生長因子(rhHGF)購自Neomark 公司;Transwell 小室購自Corning 公司;其它材料均購自Sigma 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組

人肺腺癌A549 細胞株用含10%小牛血清、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞為貼壁生長，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。按照給予rhHGF 的濃度分為4組(0、20、40、80 ng/mL)，不給予rhHGF 為對照組，其余為實驗組。

1.3 MTT 法測定細胞增殖率

用100 μL 細胞懸液(8 ×104/mL)接種96 孔板，每組3 復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(SFM)24 h;棄上清液，用rhHGF+SFM(分組同上)培養(yǎng)48 h;棄上清液，加入MTT 溶液，培養(yǎng)4 h;棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解。在酶聯(lián)免疫儀570 nm 處測吸光值(A 值);實驗結(jié)果判斷:以A 值及細胞增殖率表示。細胞增殖率=(A實－A對)/A對×100%

1.4 黏附試驗

在超凈臺中用Matrigel 膠包被96 孔板并風干過夜;2% BSA 50 μL/孔封閉，37 ℃孵育2 h，PBS 沖洗并棄去;將150 μL 細胞懸 液(2 ×105/mL 細胞+SFM)接種96 孔板，設(shè)3 復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)2 h;棄去培養(yǎng)基，加入200 μL PBS/孔，輕輕抽吸吹打，去除未黏附細胞;棄去PBS，加入MTT 溶液，MTT 檢測與增殖率檢測方法相同。結(jié)果的計算:以A 值和黏附增加率來表示。黏附增加率=(A實－A對)/A對×100%。

1.5 移動、侵襲試驗

根據(jù)Transwell 侵襲小室模型來完成。移動試驗:24 孔板(下室)中按500 μL/孔加入SFM +10 ng/mL rhHGF 并設(shè)3 復(fù)孔;在每孔中放細胞培養(yǎng)小室(上室)，小室底部附有多聚碳酸酯膜(8 μm 孔)，將100 μL 細胞懸液(1 ×105/mL 細胞+SFM+不同濃度rhHGF)加入上室;常規(guī)培養(yǎng)10 h;用棉簽輕輕拭去未穿膜細胞。純甲醇固定，常規(guī)HE 染色。計數(shù):顯微鏡下隨機取5 個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取平均值表示移動力數(shù)值。侵襲試驗:上室底部的膜上均勻包被50 μL Matrigel，超凈臺中風干過夜;下室同移動試驗，將2 ×105/mL 細胞+SFM+不同濃度rhHGF，按100 μL/孔加入;常規(guī)培養(yǎng)48 h;用棉簽輕輕拭去Matrigel 及未穿膜的細胞;固定、染色、計數(shù)過程與移動試驗一致。移動/侵襲增加率=(A實－ A對)/A對×100%。

1.6 免疫細胞化學檢測蛋白

制備好細胞爬片，細胞達亞匯合狀態(tài)。按實驗設(shè)計分2組(0，80 ng/mL);棄去完全培養(yǎng)基，換SFM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去上清液，換SFM(含/不含HGF)繼續(xù)培養(yǎng)24 h;棄去上清液，PBS 充分洗滌后，4%多聚甲醛固定。陰性對照由PBS 替代一抗;用圖像分析軟件分析各種蛋白的表達。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差來表示，不同實驗組與對照組間的結(jié)果差異采用配對t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 HGF 對A549 細胞增殖和黏附性的影響

由表1 可見，實驗組不同濃度的HGF 顯著刺激A549 細胞的增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中40 ng/mL 可達到最大增殖效應(yīng)。并且實驗組與對照組相比，HGF 也明顯增加A549 細胞的黏附能力(P＜0.05)，其中40 ng/mL HGF 黏附增加率最高。

表1 HGF 對A549 細胞生長和黏附性的影響

2.2 HGF 對A549 細胞體外移動力和侵襲力的影響

由表2 可見，實驗組和對照組相比，HGF 增強了A 549 細胞的移動力和侵襲力(P 均＜0.05)，并且隨著HGF 濃度加大，移動力和侵襲力也逐漸增強。

表2 HGF 對A549 細胞體外移動力和侵襲力的影響

2.3 HGF 對A549 細胞c-Met 和E-cad 蛋白表達的影響

HGF 在A549 細胞無著色，c-Met 蛋白表達位于胞漿。未加rhHGF 處理組，E-cad 蛋白陽性部位位于A549 細胞的胞膜，相鄰細胞連接處明顯。經(jīng)HPIAS-2000 型圖像分析軟件分析，在rhHGF刺激下，c-Met 蛋白表達的灰度值為(202±30)，與未處理組(210±36)相比，差異無統(tǒng)計學意義;而E-cad 蛋白在細胞膜表達的灰度值，由未處理時的(180±15)顯著下調(diào)為(140±13)(P＜0.05)。

3 討論

HGF 是多效應(yīng)的生長因子，能夠刺激多種上皮、內(nèi)皮和間質(zhì)細胞的生長和血管生成，調(diào)節(jié)免疫活性，促進細胞增殖、移動和侵襲［1］。HGF 與跨膜蛋白c-Met 結(jié)合，c-Met 自體磷酸化，激活下游信號通路調(diào)節(jié)蛋白，引起酶促反應(yīng)，發(fā)揮生物學效能，故又稱為HGF/c-Met 系統(tǒng)或信號通路。HGF/c-Met 系統(tǒng)除了參與生理性過程，還通過配體依賴和獨立機制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展如肺癌［2］。如HGF 可促進細胞集落分散，加強細胞的移動和侵襲能力。有學者認為細胞之間黏附力下降，相鄰細胞連接松散促使細胞移動力增強。而以E-cad 為代表的細胞黏附分子是介導細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間相互黏附的糖蛋白，在高侵襲力的腫瘤細胞經(jīng)?？捎^察到E-cad 表達降低、缺失。

3.1 HGF 對A549 細胞的體外生物學效應(yīng)

HGF/c-Met 信號系統(tǒng)在胚胎發(fā)育中扮演重要角色，具有強烈的促有絲分裂的作用［3］。HGF 能夠顯著促進人類肝細胞DNA 的合成，降低FasL介導的凋亡［4］。本研究證實rhHGF 可促進A549細胞的增殖，在40 ng/mL 可達到最大的增殖，提示抑制HGF 的活性可能成為NSCLC 治療的新靶點［3］。Kasahara 等［4］報道NSCLC 患者血清HGF水平與EGFR-TKI 的治療效果顯著相關(guān)，可指導個體化治療。

腫瘤細胞與基底膜黏附性的改變是有利于侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因素。HGF 能夠增強腫瘤細胞與基底膜的黏附力，促進惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移。Elliott 等［5］在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中，通過體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)HGF 激活c-Met 后，上調(diào)CD44 的表達，增強腫瘤細胞與上皮細胞、腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附性。本研究顯示HGF 增加了A549細胞與Matrigel 膠(與基底膜主要成分相同)的黏附力，表明HGF 促使腫瘤細胞緊密黏附于基底膜上，便于瘤細胞侵襲基底膜。

細胞運動能力的大小反映了細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的潛能。Ross 等［6］研究證實HGF 可促進A549等多個NSCLC 細胞及Hela 細胞的移動，發(fā)現(xiàn)HGF 能夠激活黏著斑蛋白—樁蛋白(paxillin)，致其絲氨酸126 位點和130 位點磷酸化，導致細胞的運動能力增加，在此過程中，ERK2 起著至關(guān)重要的作用。Puri 等用100 ng/mL EGF 和HGF 處理NSCLC 細胞(H1993)2 h，在誘導H1993 細胞的運動性特別是膜邊緣波動中可導致累積效應(yīng)［7］。本研究中移動、侵襲實驗顯示隨著HGF 濃度提高，穿膜細胞數(shù)逐漸增加，說明HGF 明顯提高了A549 細胞的運動能力及侵襲基底膜能力。一系列研究表明HGF/c-Met 信號通路激活后，細胞運動能力顯著提高，并且與基底膜黏附性增強，更易于穿過基底膜，利于腫瘤細胞向遠處轉(zhuǎn)移。

3.2 HGF 對A549 細胞c-Met、E-cad 的作用

HGF 與c-Met 兩者相互協(xié)調(diào)，激活多個信號通路，共同調(diào)控非小細胞肺癌的進展［2，6，8］。本實驗發(fā)現(xiàn)A549 細胞c-Met 蛋白表達與HGF 無關(guān)，說明外源性HGF 通過旁分泌途徑對c-Met 蛋白表達影響極小，可能只是使c-Met 胞內(nèi)區(qū)磷酸化并激活c-Met，從而發(fā)揮生物學效能。

有研究發(fā)現(xiàn)HGF/c-Met 系統(tǒng)還可影響E-cad的表達。轉(zhuǎn)染c-Met 的前列腺癌細胞株出現(xiàn)Ecad 表達下降，vimentin 表達升高，細胞顯示上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［9］。Shimabukuro 等［10］發(fā)現(xiàn)加入HGF后，宮頸鱗狀細胞癌SKG?Ⅲ細胞株E-cad 和actin表達下調(diào)，免疫熒光發(fā)現(xiàn)E-cad 膜熒光受到HGF干擾，轉(zhuǎn)為核周熒光，并且腫瘤細胞的移動與侵襲能力加強，認為HGF 促使E-cad 表達降低，其介導的細胞與細胞之間黏附力缺失，導致侵襲性行為的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)HGF 可促使A549 細胞E-cad 蛋白表達下調(diào)，表明HGF 可下調(diào)E-cad 的表達，破壞E-cad/β?cat 復(fù)合物的形成，降低細胞間黏附力，增強細胞遷移能力，從而促進非小細胞肺癌的進展。在鼻咽癌的研究中也有類似報道，HGF 可通過調(diào)節(jié)E-cad 介導的細胞—細胞之間的黏附，主要是E-cad 的下調(diào)和細胞內(nèi)攝作用，從而促進鼻咽癌的侵襲［11］。

綜上所述，體外研究證實HGF 可刺激NSCLC的增殖，增加了腫瘤細胞與細胞基質(zhì)黏附性。外源性加入HGF，肺癌細胞E-cad 蛋白表達下調(diào)，促進細胞的移動和侵襲，有利于腫瘤的擴散。對于HGF 信號通路的研究有望成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的新靶點。

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