小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及功能鑒定

石任任，王珊，何穎，鄒澤紅，張可俊，李林梅，肖春梅，關(guān)志澳，陶愛(ài)林

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院/呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室變態(tài)反應(yīng)研究室/變態(tài)反應(yīng)國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科/廣東省過(guò)敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260)

·論 著·

小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及功能鑒定

石任任，王珊，何穎，鄒澤紅，張可俊，李林梅，肖春梅，關(guān)志澳，陶愛(ài)林

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院/呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室變態(tài)反應(yīng)研究室/變態(tài)反應(yīng)國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科/廣東省過(guò)敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510260)

目的：探討體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓細(xì)胞來(lái)源肥大細(xì)胞的方法，為體外組胺激發(fā)試驗(yàn)提供試材。方法：采用白細(xì)胞介素3(IL-3)和干細(xì)胞因子(SCF)聯(lián)合刺激小鼠骨髓細(xì)胞4、6周誘導(dǎo)其分化為肥大細(xì)胞，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞成熟度，蛋白免疫印跡法分析表面FcεRⅠ和CD117表達(dá)情況，HistaReader 501組胺儀檢測(cè)細(xì)胞脫顆粒能力。結(jié)果：誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周后的細(xì)胞為大小均一且具折光性的圓形懸浮細(xì)胞；甲苯胺藍(lán)染色顯示培養(yǎng)4、6周后的細(xì)胞胞核染為藍(lán)色，胞質(zhì)含有豐富的粗大紫紅色顆粒，鏡下統(tǒng)計(jì)成熟肥大細(xì)胞比例達(dá)85%以上；蛋白免疫印跡法分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4、6周后的細(xì)胞皆表達(dá)FcεRⅠ和CD117，其中培養(yǎng)6周的細(xì)胞FcεRⅠ表達(dá)水平更高；組胺儀檢測(cè)培養(yǎng)6周的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)濃度為100、500、1 000 μmol·L-1的鈣離子載體刺激后，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞組胺釋放量依次為3.86%、17.04%及23.47%(P<0.05)，其脫顆粒具有鈣離子載體濃度依賴(lài)性。結(jié)論：獲得大量高純度的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞，可促進(jìn)后期的組胺激發(fā)試驗(yàn)及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)機(jī)制研究。

肥大細(xì)胞； 骨髓； 組胺檢測(cè)； 誘導(dǎo)培養(yǎng)； 小鼠

Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)如過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性哮喘、蕁麻疹、過(guò)敏性胃腸炎、過(guò)敏性休克等嚴(yán)重影響人們的健康與生活質(zhì)量。大部分Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)都是由患者體內(nèi)肥大細(xì)胞系統(tǒng)被激活而誘發(fā)的，故此，肥大細(xì)胞是參與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞[1]。目前認(rèn)為，肥大細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)主要通過(guò)表達(dá)IgE高親和力FcεRⅠ受體，與過(guò)敏原特異性IgE抗體結(jié)合形成IgE/FcεRⅠ復(fù)合物，大量IgE/FcεRⅠ復(fù)合物交聯(lián)聚集，活化肥大細(xì)胞導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，從而引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)[2]。肥大細(xì)胞是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的初級(jí)效應(yīng)細(xì)胞，其激活直接影響次級(jí)效應(yīng)細(xì)胞嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集和激活，盡管目前存在可以傳代的肥大細(xì)胞株，然而這些細(xì)胞系常缺乏顯著的成熟肥大細(xì)胞特性和功能[3]，因此體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取大量高純度的肥大細(xì)胞對(duì)我們進(jìn)一步研究其在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病進(jìn)程中的作用有重要意義。

肥大細(xì)胞由骨髓中表達(dá)CD34和CD13抗原的多能祖細(xì)胞分化而成，廣泛分布于皮膚及內(nèi)臟黏膜下的微血管周?chē)?，與巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等共同構(gòu)成機(jī)體的第一道防線。白細(xì)胞介素3(IL-3)和干細(xì)胞因子(SCF)在骨髓細(xì)胞向肥大細(xì)胞的分化與活化過(guò)程中起著重要作用[4-5]。本研究旨在通過(guò)提取小鼠骨髓細(xì)胞，利用IL-3和SCF聯(lián)合作用誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞(BMMCs)并鑒定其純度與活性，為進(jìn)一步研究肥大細(xì)胞激活與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性及制定完善的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病診治方案提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，清潔級(jí)，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；小鼠重組IL-3、SCF購(gòu)自Peprotech公司；小鼠FcεRⅠ、CD117及Tubulin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自Abcam公司；HR-Test組胺檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biopharm公司。其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.3 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的制備與培養(yǎng)

無(wú)菌環(huán)境下鈍性分離小鼠雙側(cè)股骨，剪斷股骨兩端骨骺，用1 ml注射器吸取適量RPMI 1640培養(yǎng)基將骨髓腔內(nèi)的骨髓細(xì)胞沖至無(wú)菌培養(yǎng)板中，收集液體至15 ml離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，用含IL-3(10 ng·ml-1)、SCF(10 ng·ml-1)和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每7 d收集懸浮的細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)4周和6周后分別收集細(xì)胞，對(duì)其形態(tài)及功能進(jìn)行鑒定。

1.4 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

分別收集培養(yǎng)4、6周的懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞甩片后用1% pH 7.4的甲苯胺藍(lán)染液染約30 s，體積分?jǐn)?shù)95%的酒精分色，雙蒸水洗滌，光鏡下觀察。

1.5 蛋白免疫印跡法分析小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞FcεRⅠ及CD117表面分子表達(dá)

收集誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周的懸浮細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，BCA蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.1% PBST清洗4次，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；0.1% PBST清洗2次，分別滴加稀釋后的一抗(FcεRⅠ、CD117、Tubulin)4 ℃孵育過(guò)夜；0.1% PBST清洗4次，滴加稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(二抗)，室溫孵育1 h；0.1% PBST清洗2次，PBS清洗2次后滴加化學(xué)發(fā)光劑曝光。

1.6 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞脫顆粒能力檢測(cè)

按照HR-Test組胺檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用配套試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體步驟為：在玻璃纖維板上分別加入25 μl·孔-1的pipes緩沖液、0.5% Triton X-100及不同濃度(100、500、1000 μmol·L-1)的鈣離子載體，再加入25 μl(約3000個(gè)細(xì)胞)誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞，混勻后37 ℃孵育1 h；雙蒸水清洗5次，加入結(jié)合緩沖液75 μl·孔-1，室溫孵育10 min；加入終止緩沖液75 μl·孔-1終止反應(yīng)，利用HistaReader 501組胺儀檢測(cè)肥大細(xì)胞組胺釋放量。經(jīng)0.5% Triton X-100處理的肥大細(xì)胞組胺釋放量設(shè)定為組胺最大釋放量；經(jīng)pipes緩沖液處理的肥大細(xì)胞組胺釋放量設(shè)定為組胺基礎(chǔ)釋放量。肥大細(xì)胞組胺釋放量(%)=(待測(cè)肥大細(xì)胞組胺釋放量-組胺基礎(chǔ)釋放量)/(組胺最大釋放量-組胺基礎(chǔ)釋放量)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件按以下方法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)組與空白組之間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

加入細(xì)胞因子IL-3、SCF培養(yǎng)72 h后開(kāi)始出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，多為長(zhǎng)梭形，并可見(jiàn)大小不一的懸浮細(xì)胞(圖1A)；培養(yǎng)7 d后貼壁細(xì)胞逐漸減少，圓形懸浮細(xì)胞逐漸增多(圖1B)；培養(yǎng)4～6周，懸浮細(xì)胞大小、形狀、分布逐漸均勻且具有折光性(圖1C、D)。

圖1 光鏡下觀察不同誘導(dǎo)時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)(×200) A.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d； B.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d； C.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4周； D.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)6周

Fig 1 Morphology of cells under light microscope in different induced culturing periods(×200)A.Cells after 3 days’ induced culturing； B.Cells after 7 days’ induced culturing； C.Cells after 4 weeks’ induced culturing； D.Cells after 6 weeks’ induced culturing

2.2 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色

誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周后收集懸浮細(xì)胞進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，可見(jiàn)細(xì)胞胞核為藍(lán)色，大部分胞質(zhì)含有豐富的紫紅色異染顆粒(圖2)，表明所收集的細(xì)胞確有吞噬甲苯胺藍(lán)的特性，鏡下統(tǒng)計(jì)超過(guò)85%的懸浮細(xì)胞為成熟肥大細(xì)胞。

圖2 甲苯胺藍(lán)染色不同誘導(dǎo)時(shí)期的細(xì)胞(×1 000) A.未誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞； B.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)4周； C.細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)6周

Fig 2 Toluidine blue staining of cells in defferent induced culturing periods(×1 000)A.Cells without induced culturing； B.Cells after 4 weeks’ induced culturing； C.Cells after 6 weeks’ induced culturing

2.3 蛋白免疫印跡法分析小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞FcεRⅠ及CD117分子表達(dá)

分別用細(xì)胞因子IL-3、SCF誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周后收集懸浮細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡法分析所誘導(dǎo)培養(yǎng)的肥大細(xì)胞表面FcεRⅠ及CD117表達(dá)情況。誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周后，相對(duì)于未誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞，小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞表面FcεRⅠ及CD117分子表達(dá)量明顯增多；另外與誘導(dǎo)培養(yǎng)4周的細(xì)胞相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞表面FcεRⅠ的表達(dá)水平更高(圖3)，表明誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的小鼠來(lái)源肥大細(xì)胞成熟度更佳。

圖3 蛋白免疫印跡法分析不同誘導(dǎo)時(shí)期的細(xì)胞表面FcεRⅠ及CD117分子表達(dá)

Fig 3 Western blotting analysis of FcεRⅠand CD117 expression of cells in defferent induced culturing periods

2.4 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞脫顆粒能力檢測(cè)

收集誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞，分別與pipes緩沖液、0.5% Triton X-100及不同濃度的鈣離子載體孵育1 h后，檢測(cè)肥大細(xì)胞組胺釋放量。結(jié)果顯示，經(jīng)濃度為100、500、1 000 μmol·L-1的鈣離子載體孵育后，與對(duì)照組相比，小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞組胺釋放量依次為3.86%、17.04%及23.47%(P<0.05)(圖4)，表明所誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞能被鈣離子載體活化脫顆粒釋放組胺，且具有濃度依賴(lài)性，具備良好的成熟肥大細(xì)胞活性。

aP<0.05

圖4 小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞組胺釋放

Fig 4 Histamine release of BMMCs

3 討 論

IL-3又稱(chēng)為多重集落刺激因子和造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能刺激多能干細(xì)胞和多種祖細(xì)胞的增殖與分化；SCF可增強(qiáng)肥大細(xì)胞的增殖、存活、分化和趨化的能力，在肥大細(xì)胞的發(fā)育和存活中起關(guān)鍵作用[6]。肥大細(xì)胞在IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中有著至關(guān)重要的作用，而肥大細(xì)胞的細(xì)胞表面需要表達(dá)FcεRⅠ才能識(shí)別特異性IgE，進(jìn)而參與Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)[7]；CD117(c-Kit)為干細(xì)胞因子受體，是另一種影響肥大細(xì)胞功能的重要受體，調(diào)控肥大細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，并可增強(qiáng)FcεRⅠ交聯(lián)引起肥大細(xì)胞脫顆粒的能力[8]，故可通過(guò)檢測(cè)肥大細(xì)胞表面FcεRⅠ和CD117的表達(dá)來(lái)對(duì)所誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞進(jìn)行鑒定[9]。本研究采用IL-3和SCF聯(lián)合刺激小鼠骨髓細(xì)胞4～6周，誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后即可見(jiàn)大量大小均一、分布均勻且具有折光性的圓形懸浮細(xì)胞，而誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的細(xì)胞，其細(xì)胞形態(tài)上與誘導(dǎo)培養(yǎng)4周的細(xì)胞類(lèi)似。甲苯胺藍(lán)染色顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周后，大部分的細(xì)胞內(nèi)皆可見(jiàn)粗大的、紫紅色異染性的顆粒，鏡下統(tǒng)計(jì)成熟肥大細(xì)胞比例占到85%以上；同時(shí)蛋白免疫印跡法分析顯示，誘導(dǎo)培養(yǎng)4、6周的肥大細(xì)胞明顯表達(dá)FcεRⅠ和CD117分子，且誘導(dǎo)培養(yǎng)6周的肥大細(xì)胞FcεRⅠ表達(dá)水平更高，成熟度更佳。故相比于較為傳統(tǒng)的腹腔沖洗液分離肥大細(xì)胞或磁珠分離肥大細(xì)胞獲取細(xì)胞數(shù)量有限、成本高[10]，本研究采用的骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)肥大細(xì)胞的方法更為經(jīng)濟(jì)、便捷，同時(shí)保證了獲取的肥大細(xì)胞的數(shù)量、純度和成熟度。

組胺是肥大細(xì)胞內(nèi)組氨酸脫羧基后產(chǎn)生的一種胺類(lèi)物質(zhì)，是肥大細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志物質(zhì)，故檢測(cè)肥大細(xì)胞釋放組胺的量，可以了解肥大細(xì)胞活化脫顆粒情況。在肥大細(xì)胞的脫顆粒機(jī)制中，Ca+/Ca M蛋白激酶系統(tǒng)是經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)，Ca+內(nèi)流使細(xì)胞內(nèi)Ca+濃度升高，從而導(dǎo)致組胺釋放增加[11]。本研究將誘導(dǎo)培養(yǎng)的肥大細(xì)胞與不同濃度的Ca+載體共孵育，激活Ca+/Ca M蛋白激酶系統(tǒng)導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放組胺，通過(guò)HistaReader 501組胺儀直接檢測(cè)肥大細(xì)胞組胺的釋放量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，與鈣離子載體孵育后，誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞皆可釋放組胺且組胺釋放量與鈣離子載體濃度成正比，表明本研究中誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞具有良好的活性。另外，組胺半衰期短，容易降解，故能否及時(shí)而準(zhǔn)確地檢測(cè)組胺是影響Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)診治的不可忽視的因素。本研究使用HistaReader 501組胺儀直接檢測(cè)肥大細(xì)胞組胺釋放情況，敏感性較好且步驟簡(jiǎn)單、用時(shí)短，具有良好的使用前景，為更好地利用組胺激發(fā)試驗(yàn)，研究肥大細(xì)胞在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中的作用提供參考。

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Induced culture and functional identification of mouse bone marrow-derived mast cell

SHI Ren-ren，WANG Shan，HE Ying，ZOU Ze-hong，ZHANG Ke-jun，LI Lin-mei，XIAO Chun-mei，GUAN Zhi-ao，TAO Ai-lin

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAllergy&ClinicalImmunology，TheStateKeyClinicalSpecialtyinAllergy，TheStateKeyLaboratoryofRespiratoryDisease，TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510260，China)

Objective: To investigate induced culture methods of bone marrow-derived mast cells(BMMCs) to provide materials for allergen challenge assay. Methods: BMMCs were differentiated from bone marrow cells cultured for 4 to 6 weeks with interleukin-3(IL-3) and stem cell factor (SCF) supplemented. The cell features were characterized by light microscopy and toluidine blue staining. The maturity of the cells was investigated by analyzing the membrane markers FcεRⅠand CD117 by Western blotting， and potency of BMMCs was calculated through histamine release assay by HistaReader 501 instrument. Results: The induced BMMCs， all in uniformed size with refraction， were observed to be filled with typical purple granules. The mature mast cells accounted for more than 85% of all cells. FcεRⅠand CD117 were positively expressed in BMMCs and FcεRⅠwere more expressive after 6 weeks of culture. The rate of histamine release by BMMCs cultured for 6 weeks were 3.86%， 17.04% and 23.47% (P<0.05) after stimulated with calcium ionophore at concentrations of 100， 500 and 1 000 μmol·L-1， compared to control group. Conclusion: A large amount of highly purified BMMCs have been obtained， which will facilitate the subsequent allergen challenge assay and mechanism research on typeⅠallergy．

mast cell； bone marrow； histamine detection； induced culture; mice

2015-05-15

2015-05-25

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目(2014ZX08011-005B)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373128)；國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目(520102)

石任任(1987-)，女，廣東佛山人，在讀碩士研究生。E-mail:doreen87@163.com

陶愛(ài)林 E-mail:aerobiologiatao@163.com

石任任，王珊，何穎，等.小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及功能鑒定[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：684-688．

Q813.11

A

1671-6264(2015)05-0684-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.002