基于系統(tǒng)-合成生物學的人工細胞網絡設計

汪建峰 王 勇（中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學重點實驗室，上海 200032）

基于系統(tǒng)-合成生物學的人工細胞網絡設計

汪建峰 王 勇
（中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學重點實驗室，上海 200032）

汪建峰，博士，助理研究員，主要研究方向為復雜天然產物異源合成系統(tǒng)的設計。

E-mail:jfwang@sibs.ac.cn

在過去的十多年里，研究人員利用合成生物學方法在模式微生物底盤中設計和重建了一系列重要天然化合物的異源合成模塊，大大拓展了微生物發(fā)酵在珍稀藥物、食品添加劑、生物能源和精細化學品生產領域的應用價值。為了實現異源產物的高產量和高得率，必須綜合運用系統(tǒng)生物學和合成生物學方法，對異源模塊進行優(yōu)化設計，強化底盤細胞的前體和能量合成，并改善模塊的適配性，最終實現異源化合物的高產。文章綜述了近年來在人工細胞網絡設計上的進展。

王勇，博士，中國科學院“百人計劃”研究員，主要研究方向為天然產物的合成生物學。

E-mail:yongwang@sibs.ac.cn

在過去的十多年里，研究人員利用合成生物學方法在大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等常見的模式微生物底盤（Chassis）中設計和重建了一系列重要萜類 、苯丙烷素類 、聚酮類 等天然化合物的異源合成模塊，成功賦予了原有底盤細胞生產重要外源化合物的能力，大大拓展了微生物發(fā)酵在珍稀藥物、食品添加劑、生物能源和精細化學品生產領域的應用價值。為能夠快速響應環(huán)境變化并以最經濟的狀態(tài)生存，由自然進化而來的初始底盤細胞代謝網絡往往存在著大量支路代謝、可逆代謝、補償代謝等途徑，而且在基因轉錄、蛋白翻譯、酶活水平等各個層次受到極其復雜、嚴謹的調控。因此，初始底盤細胞內源代謝僅能向異源代謝模塊提供極少量的前體和能量來進行異源產物的生產。為了實現異源產物的高產量和高得率，除了需要對異源模塊進行設計優(yōu)化外 ，另一個迫切的研究內容是如何利用各種工程策略強化底盤細胞的前體和能量合成，并改善內源模塊和異源模塊的適配性（如空間尺度的接近、時間尺度的同步等）。經典誘變育種方法隨機性強、定向篩選困難、過程周期漫長。傳統(tǒng)代謝工程的方法僅對局部代謝網絡中單個或者少數靶點進行改造，難以達到預期目標。大腸桿菌與釀酒酵母等底盤細胞具有遺傳背景清晰、遺傳操作手段成熟等優(yōu)點。針對這些模式微生物，研究人員已經建立了各種成熟的系統(tǒng)生物學研究方法與工具，如組學分析 、全基因組規(guī)模代謝模型（GSMM）、in silico的代謝網絡分析 等，同時也開發(fā)了一整套合成生物學研究工具和技術，如精細可控的表達調控元件、基因回路DNA裝配和染色體工程技術 等。因此，結合運用這些系統(tǒng)生物學和合成生物學方法，可以快速鑒定全基因組規(guī)模潛在遺傳靶點，并對大量靶點實施精準、快速的改造與集成，最終大大提高菌株改造的效率和周期，實現異源化合物的高產 。

1 全基因組規(guī)模靶點預測與診斷

1.1 全基因組規(guī)模in silico細胞網絡分析的靶點預測

隨著大量微生物全基因組測序和注釋工作的完成，研究人員對微生物復雜的全基因組規(guī)模代謝網絡有了更全面深入的認識。基于基因-蛋白質-生化反應的相互關系，將全基因組代謝網絡抽象為一系列按一定計量關系運行的生化反應，然后可以利用計量系數矩陣模型建立基因組規(guī)模代謝模型（GSMM）。以GSMM為基礎，運用一系列基于預先假定的約束條件（如最大菌體生長、最大產物合成）進行全細胞代謝網絡流量分析，如通量平衡分析（FBA）、最小代謝調整分析（MOMA）等，可以發(fā)現大量能改善目標產物合成的潛在途徑或基因，特別是一些與產物合成相距較遠、表觀上無直接關聯(lián)的靶點。相比于傳統(tǒng)方法，這些信息可以更理性地指導發(fā)現更多有效的基因靶點，減少實驗的盲目性。自從Edwards等 2000年發(fā)表了第一個GSMM以來，經過十年的發(fā)展，至今已建立了超過100個物種的基因組尺度代謝模型（表1）。隨著對細胞代謝網絡認識的加深，更多的信息被整合到了模型中，大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物的代謝網絡模型被不斷更新，為更全面、徹底地預測細胞表型和遺傳靶點奠定基礎。

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目前全基因組規(guī)模的in silico細胞網絡分析已經被廣泛應用到了傳統(tǒng)工業(yè)生產菌株和一些天然化合物異源合成工程菌株的改造中。研究人員通過對全基因組模型的進一步修正和約束算法的優(yōu)化，不斷強化預測的全面性和準確性。Alper等 利用MOMA方法，預測并鑒定了大腸桿菌中能提高番茄紅素合成的基因敲除靶點。隨后，Choi等 開發(fā)了限制目標流量的流量掃描分析方法（FSEOF），不僅預測了大腸桿菌中能提高番茄紅素合成的敲除靶點，同時也獲得了一些潛在的強化靶點。筆者實驗室為了進一步提高in silico預測效率，以經典的FBA和MOMA算法為基礎，開發(fā)了流量分布比較分析（FDCA）和LMOMA-based兩種新的算法 。首先，FDCA算法是以基因組范圍的代謝模型為基礎，分別采用最大菌體生長和最大產物合成作為約束條件，利用FBA方法計算各自約束條件下代謝通量分布，通過進一步比較這兩種狀態(tài)下的流量分布情況，找出所有顯著上調或下調的節(jié)點（反應），這些節(jié)點即是理論上潛在改造靶點。因此，FDCA實質是in silico代謝流量組的比較分析，它可以從全基因組規(guī)?？焖僬业接绊懩硞€表型的所有潛在敲除、強化或弱化靶點。其次，LMOMA-Based算法以LMOMA（線性MOMA）方法為基礎發(fā)展的，意在實現對全基因組范圍模型中的所有靶點進行深入的疊加敲除分析。該算法的每一輪敲除都是對全基因組范圍所有靶點的一次全掃描敲除分析，在找到該輪敲除中

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表1 幾種重要底盤微生物的全基因組代謝網絡模型

1.2 基于組學數據比較分析的細胞網絡診斷

基于GSMM計量模型的in silico代謝網絡方法可以快速鑒定理論上的敲除、弱化或強化靶點，但目前這種計量模型分析僅僅反應某種理想狀態(tài)下靜態(tài)的代謝流量分布，無法體現細胞內代謝狀態(tài)（如RNA豐度、酶濃度、代謝物濃度等）的動態(tài)變化和復雜調控，因而無法指導開展更精細的遺傳改造，如基因表達劑量優(yōu)化、基因表達時間上的開關等，同時也無法反映實驗條件下細胞受到的各種環(huán)境脅迫作用，如菌株的耐受性等。借助全基因組范圍或某個核心代謝模塊的轉錄組、蛋白質組、代謝組、代謝流量組等分析，可有效掌握細胞內酶、底物、中間代謝物及產物濃度的動態(tài)變化。這樣的系統(tǒng)診斷分析對如何進一步設計高產菌株和選取最有效的改造策略具有重要意義。

細胞內RNA水平直接影響轉錄和翻譯兩個重要的基因表達過程。通過基于微陣列芯片和RNA-seq的轉錄組分析，可以快速鑒定特定條件下大量基因轉錄水平的變化，從而發(fā)現未知的基因表達調控規(guī)律以及許多與耐受性相關靶點。Foo 等 利用比較轉錄組方法分析了大腸桿菌宿主在外源添加高濃度異戊烯醇環(huán)境下基因轉錄水平的變化，發(fā)現并驗證了與氧化脅迫響應、通用脅迫響應、熱激響應和產物轉運相關的8個靶點的強化表達能夠提高宿主對異戊烯醇耐受性。進一步對高產異戊烯醇工程菌株測試，發(fā)現有6個靶點過表達能夠強化異戊烯醇的合成，其中蛋氨酸合成調節(jié)子MetR能使異戊烯醇產量提高55%。Hess等 借助轉錄組分析對各種不同環(huán)境條件下具有不同異戊二烯產量的枯草芽孢桿菌的基因表達譜進行研究。他們將其中的213個受調控基因的表達與異戊二烯的產量關聯(lián)起來，并構建了相關預測模型。這些相關的分析可以有效地指導菌株的后續(xù)改造及培養(yǎng)條件優(yōu)化。

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基于選擇性監(jiān)測質譜（selectedreaction monitoring，SRM）的靶向蛋白質組方法可以直接有效地對相關代謝途徑中酶豐度進行定量 。相對于轉錄組分析，蛋白質組信息能夠更加直觀地反映基因表達狀況和細胞代謝狀態(tài)。Redding-Johanson等 利用靶向蛋白質組學的方法對表達酵母來源MVA途徑的產萜類大腸桿菌進行了系統(tǒng)研究。他們發(fā)現酵母來源甲羥戊酸激酶（MK）和磷酸甲羥戊酸激酶（PMK）是潛在的代謝瓶頸。基于該結果，通過密碼子優(yōu)化和替換強啟動子的方法從翻譯和轉錄兩個方面有效地提高了MK和PMK蛋白在細胞內水平，從而使紫槐二烯的產量提高了3倍。代謝組分析技術的進步也進一步便于代謝網絡中各種代謝物的定量。Weaver等 結合采用靶向蛋白組和代謝組分析方法對產萜類大腸桿菌中MVA前體途徑和紫槐二烯異源合成模塊中的酶和代謝分別進行了定量分析。結合局部網絡中酶和代謝物的濃度信息，他們利用常微分方程構建了該代謝通路的動力學模型。通過對模型進行全局敏感性分析發(fā)現兩個重要的信息：①紫槐二烯合成酶的濃度與紫槐二烯的產量相關；②解除FPP對MK酶的反饋抑制作用，不影響產物合成。他們又進一步證實了由動力學模型分析得出的以上兩個結論與實驗結果是一致的。隨著各種組學分析方法可靠性和檢測通量的增加，結合運用這些方法可以幫助更準確地理解更大范圍的細胞網絡動態(tài)行為，更加便于對工程菌株進行靶點診斷分析。

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2 細胞網絡重構的高效遺傳操作及DNA裝配方法

系統(tǒng)生物學的方法可以為高產菌株的設計提供大量全基因組范圍的潛在靶點。如何快速地對所有潛在靶點及各種靶點組合進行精細改造與測試，并將所有關鍵靶點進行集成以最終獲得滿足工業(yè)化生產的高產菌株，是亟待解決的問題。過去十多年的合成生物學研究，積累了許多精細可控的基因表達調控元件以及元件的定量設計方法，為精細的調控基因的表達提供了豐富的元件。同時，高效的基因編輯技術也被開發(fā)來實現染色體范圍多靶點快速改造與集成 。以大腸桿菌系統(tǒng)為例，傳統(tǒng)同源重組打靶質粒構建，重組效率低。以噬菌體重組系統(tǒng)開發(fā)的λ大腸桿菌等重組技術直接用外源線性雙鏈或單鏈DNA分子打靶染色體上大量靶點，大大縮短了大腸桿菌基因每次敲除的周期，提高了重組效率。尤其是線性單鏈DNA作為靶分子時，重組效率達到了90%。以線性單鏈DNA打靶為基礎，Wang等 進一步開發(fā)了功能更強大的多元自動化染色體改造方法（multiplex automated genome engineering， MAGE），通過設計自動化可重復循環(huán)進行染色體改造的實驗裝備，在數天內快速完成對染色體內大量靶點重新洗牌。筆者以大腸桿菌番茄紅素合成工程菌為優(yōu)化對象，采用MAGE技術對潛在的24個與萜類合成有關的關鍵基因靶點的RBS區(qū)域的序列進行了進化改造。3天后, 從數以億計的突變克隆中成功地篩選到了高產菌株。該方法實現了染色體上大量位點的并行改造，大大提高了基因編輯的效率。CRISPR/Cas技術是被最新開發(fā)的一個更為簡易高效的染色體編輯技術 。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/Cas （CRISPR associated）是天然存在于細菌和古細菌中的一種免疫系統(tǒng)。CRISPR/ Cas系統(tǒng)由crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白組成。crRNA負責識別入侵的靶點序列，crRNA/tracrRNA與Cas9蛋白結合，然后引導Cas9對DNA雙鏈進行切割。近年來，研究人員利用CRISPR/Cas特異性識別和染色體雙鏈切割功能，將CRISPR/ Cas開發(fā)成高效地基因組敲除技術，并在哺乳動物細胞、真菌及細菌等系統(tǒng)中取得成功。該方法重組效率極高，能夠有效地進行多靶點的同時改造，因此將在高產菌株全基因組范圍靶點的改造中發(fā)揮越來越大的作用。對于染色體序列的修改，利用人工設計的非編碼RNA可以更加方便地調控相應基因在轉錄、翻譯水平的抑制 。

除高效的染色體編輯技術外，復雜的細胞網絡優(yōu)化也對DNA大片段組裝乃至染色體拼接提出了更高的要求 。近年來，研究人員開發(fā)了一系列高效的體外拼接方法，包括生物磚系統(tǒng)（BioBricks、BglBricks） 、In-FusionTM同源重組 、Gibson等溫法 、非序列及非連接依賴性克?。⊿LIC） 等，都能夠很好地用于幾十kb的DNA片段。相比于體外連接方法，借助酵母強大的同源重組能力，可更快速地實現許多帶有特定同源末端的DNA片段連接成大片段的DNA分子，且具有相當高的精確性，該方法顯示出了巨大的應用前景 。目前，研究人員已經成功利用該技術重構了番茄紅素的生物合成基因簇、宏基因組來源的聚酮生物合成基因簇等。Wingler等 在酵母系統(tǒng)開發(fā)了迭代重組方法，實現了多基因途徑的快速組裝和優(yōu)化。Sleight等 也開發(fā)了隨機BioBrick組裝方法進行基因回路和番茄紅素途徑的隨機裝配，結合高通量篩選方法實現途徑的快速優(yōu)化。雖然DNA合成技術在組裝長度、準確性、高通量、自動化、低成本等方面取得了巨大進步，但這些技術仍然存在著各自的缺點，需要進一步的發(fā)展和整合，以適應合成生物學發(fā)展的需要。

3 人造細胞代謝網絡的適配與重編程

3.1 代謝網絡的動態(tài)適配

對于自然進化而來的微生物，隨著其生長階段和環(huán)境的變化，細胞內基因表達也是一個動態(tài)變化的過程，以滿足細胞以最經濟的方式運行。傳統(tǒng)方法通過誘導型或組成型啟動子調控下游合成途徑或強化前體途徑限速步驟基因表達、抑或是敲除分支途徑基因的方法，雖能在一定程度上提高目標產物的合成，但這些策略無法使關鍵基因的表達動態(tài)地適應菌株生長變化和環(huán)境擾動，也無法使細胞實時地處在前體供應與前體消耗的動態(tài)平衡下。這些內源代謝途徑與下游途徑基因表達的不適配，往往會造成細胞在酶水平和代謝物水平的浪費與生長負擔。如當胞內前體流量供應改善后，若下游途徑的表達維持不變，會引起中間代謝物的大量積累并造成細胞毒性和相關酶的反饋抑制。反之，當胞內前體流量供應降低后，下游途徑的表達也可以適量減弱，從而減弱細胞的負擔。因此利用動態(tài)的調控回路，協(xié)同上游途徑和下游途徑的表達，可以經濟有效地提高菌株產物合成 。針對這樣的改造目標，能響應細胞內特定代謝物的元件以及合成生物學基因調控回路是非常重要的改造工具。

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為了實現這樣的動態(tài)調控，Farmer 等 首次在產番茄紅素大腸桿菌中設計了響應細胞內代謝物乙酰磷酸的動態(tài)回路，通過乙酰磷酸胞內濃度的動態(tài)變化來調控番茄紅素下游合成模塊的表達，有效促進了番茄紅素的合成。Xu等 利用了脂肪酰-CoA響應的轉錄調控因子FadR構建了基因回路，動態(tài)調控乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合酶的表達，從而提高菌株脂肪酸合成。但是在多數情況下，缺乏可用于特定回路設計的響應元件來控制和協(xié)同基因的動態(tài)表達。結合轉錄組學等系統(tǒng)生物學方法，可以發(fā)現有效的調控因子用于回路設計。研究表明，法呢基焦磷酸（FPP）是倍半萜合成的直接前體, 需要很強的FPP代謝流量才能滿足萜類的大量合成需要。但是FPP具有很強的細胞毒性，在引入優(yōu)化后的MVA途徑的E. coli萜類合成高產菌株中，往往由于下游模塊的表達水平無法與FPP供應水平相協(xié)同，FPP會在細胞內積累并造成細胞生長的抑制。Dahl等 利用轉錄組分析的方法，發(fā)現了能夠對萜類代謝中間體FPP作出壓力響應的調控元件。利用該調控元件設計了控制紫槐二烯和甲羥戊酸合成途徑的動態(tài)回路，有效地促進了紫槐二烯的合成。Yuan等 利用實時定量PCR （qRT-PCR）的方法分析了釀酒酵母菌株中相關基因的表達情況，發(fā)現ERG11、ERG2、ERG3三個基因的表達在胞內麥角固醇積累時是下調的，并鑒定了受麥角固醇調控的啟動子。當利用這些麥角固醇響應啟動子調控 ERG9表達時，異源萜類化合物的產量可以提高2～5倍。

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3.2 代謝網絡的系統(tǒng)化重構與適配

為了進一步提高菌株產量，研究人員從細胞全局網絡的角度開展了菌株的系統(tǒng)化重構和適配研究，并取得了一系列的成果。Zhao等 采用啟動子工程和模塊化代謝工程策略對大腸桿菌中心代謝網絡中涉及萜類前體合成、NADPH、ATP供應的靶點進行系統(tǒng)的測試與集成改造，成功提高了β-胡蘿卜素的合成。Meng等 以大腸桿菌iAF1260模型為基礎，將該全基因組in silico代謝流量分析應用到了大腸桿菌萜類合成體系優(yōu)化中，并由Wang等 成功鑒定了一系列能提高萜類合成的新靶點。利用釀酒酵母的甲羥戊酸途徑進行萜類的高效合成已經比較成熟。為了進一步提高釀酒酵母萜類合成的能力，Meng和Sun等 以釀酒酵母iMM904全基因組模型為基礎，利用FDCA和MOMA算法，預測并獲得了一系列能提高萜類合成、但不顯著影響菌體生長的新的改造靶點。隨后通過基因敲除實驗，以很高的預測準確度發(fā)現了SER3、SER33、SOR1等10個靶點的單敲除能夠使萜類合成提高8～10倍。此外，為了實現酵母前體供應和下游合成途徑代謝流的平衡，Ding等 采用計算機輔助設計的方法預測并發(fā)現了最高效的GGPP合成酶，并通過實驗成功解決了一個酵母系統(tǒng)紫杉醇關鍵中間體taxadiene合成的關鍵瓶頸。

由于異源聚酮合成模塊和底盤細胞前體模塊之間的不適配，使得紅霉素大腸桿菌異源合成菌株的效率非常低。為了改善紅霉素等聚酮類化合物在大腸桿菌中的合成，筆者研究組以紅霉素前體6dEB合成菌株為基礎，首先結合運用基因組尺度的in silico代謝網絡分析和比較轉錄組分析系統(tǒng)地研究了聚酮合成模塊（以紅霉素前體6dEB合成模塊為例）和內源代謝模塊在細胞代謝和基因轉錄兩個層次的相互作用 ?；蚪M尺度的in silico代謝網絡分析反映了在理論條件下細胞達到6dEB最大合成產率的代謝流量分布情況及潛在的關鍵靶點。以最大生長速率（Vmax，growth）（理想狀況下）和6dEB最大合成速率（Vmax，synthesis）（目標狀況下）作為目標函數，通過基于FDCA方法的in silico代謝網絡分析發(fā)現了大量潛在的改造靶點。另一方面，通過比較轉錄組分析在啟動6dEB合成相關基因表達并添加丙酸鹽后，發(fā)現共有629個基因的表達產生明顯變化。這些基因分布在40個不同的代謝模塊中。隨后采用了snRNA技術，快速地對大量潛在靶點進行了系統(tǒng)改造，通過弱化提高聚酮化合物產量，發(fā)現20多個可使產量提高20%以上的新靶點 。

相比于復雜的細胞網絡改造，利用合成生物學方法在體外重構局部代謝網絡，可以更好地研究網絡特性、指導細胞內代謝網絡的重構。Zhu等 首先在體外重構了萜類前體合成甲羥戊酸途徑和法尼希下游合成，并對該系統(tǒng)各組分進行分析。然后以此為基礎，通過在大腸桿菌中定量分析和表達甲羥戊酸途徑與法尼希合成途徑中的各個重要酶，成功地提高了大腸桿菌法尼希的合成。

4 結 論

隨著DNA合成與裝配技術越來越成熟，大量天然化合物異源合成途徑被成功組裝，高效微生物異源體系設計的焦點已經轉移到如何通過對細胞全局網絡的設計來實現菌株的高產，并最終可用于生產實踐。系統(tǒng)生物學和合成生物學分別為菌株細胞網絡分析診斷與遺傳改造提供了強大的工具與方法。系統(tǒng)生物學技術，特別是蛋白質組、代謝物組等檢測與數據分析方法的日益成熟使生物工程師們可以對復雜的細胞代謝過程有更實時、全局的診斷?；谶@些數據建立相關的動態(tài)模型，分析這些整合了動力學數據、細胞調控特性的全基因組網絡模型，可以更加準確地發(fā)現一系列新的改造靶點和靶點組合，這將徹底改變傳統(tǒng)以隨機誘變和篩選為主的黑箱方法來進行工業(yè)菌株改造 。同時，合成生物學技術的發(fā)展為菌株的改造提供了強大、高效的DNA操作方法、染色體編輯技術，以及理性的細胞網絡設計方法。這些合成生物學方法和策略為快速實現菌株改造和測試奠定了基礎。因此，基于系統(tǒng)-合成生物學的人工細胞網絡設計與優(yōu)化方法將成為后基因組時代微生物工業(yè)菌株優(yōu)化的重要策略。

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