GSNO對(duì)雞球蟲(chóng)LDH和G-6-PD活性的影響

徐 凱王建玉劉幸昌楊君照姚頂林

（1.鹽城市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇鹽城 224400；2.阜寧縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇阜寧 224400；3.阜寧縣陳良鎮(zhèn)人民政府，江蘇阜寧 224400；4.泰州市高港區(qū)畜牧獸醫(yī)站，江蘇泰州 225300）

GSNO對(duì)雞球蟲(chóng)LDH和G-6-PD活性的影響

徐 凱1王建玉2劉幸昌2楊君照3姚頂林4

（1.鹽城市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇鹽城 224400；2.阜寧縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇阜寧 224400；3.阜寧縣陳良鎮(zhèn)人民政府，江蘇阜寧 224400；4.泰州市高港區(qū)畜牧獸醫(yī)站，江蘇泰州 225300）

資料顯示，GSNO對(duì)雞球蟲(chóng)卵囊有較強(qiáng)的抑制作用，可以完全阻止E.tenella的孢子生殖，球蟲(chóng)卵囊的孢子生殖是一有氧呼吸過(guò)程，為了探索GSNO對(duì)球蟲(chóng)卵囊呼吸有關(guān)酶活性的影響，本實(shí)驗(yàn)利用PAGE法分析了與呼吸關(guān)系密切的乳酸脫氫酶（LDH）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）。電泳后活性染色結(jié)果表明，GSNO處理的未孢子化和孢子化卵囊的LDH和G-6-PD條帶與對(duì)照組的沒(méi)有明顯區(qū)別，這提示LDH和G-6-PD的活性沒(méi)有受到GSNO的影響。

柔嫩艾美耳球蟲(chóng) 亞硝基谷胱甘肽 乳酸脫氫酶 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶

雞球蟲(chóng)病是集約化雞場(chǎng)常見(jiàn)病之一，其發(fā)病率為50%～70%，死亡率為20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%[1～2]。在雞的各種禽病中，球蟲(chóng)病發(fā)病率最高[3]，1/6～1/5。估計(jì)每年全球因3病的損失為8億元，在我國(guó)僅抗球蟲(chóng)藥的年消費(fèi)額就達(dá)2.4～4.8億人民幣[5]。雞球蟲(chóng)病的病原體屬艾美耳屬，世界上公認(rèn)有7種，分別是柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)、毒害艾美耳球蟲(chóng)、布氏艾美耳球蟲(chóng)、和緩艾美耳球蟲(chóng)、早熟艾美耳球蟲(chóng)，另有哈氏艾美耳球蟲(chóng)和變位艾美耳球蟲(chóng)兩個(gè)可疑種。雞球蟲(chóng)沒(méi)有交叉免疫原性[6]，雞可以同時(shí)感染幾種球蟲(chóng)，而且不同的地理區(qū)域球蟲(chóng)種類的分布和優(yōu)勢(shì)種有所不同[7，8]。不同種類的球蟲(chóng)其致病性有著很大的差異[9]，而且對(duì)同一種藥物的敏感性也不一致，因而了解不同地理區(qū)域球蟲(chóng)種類的分布對(duì)于雞球蟲(chóng)病的防治具有指導(dǎo)意義。雞球蟲(chóng)病對(duì)雛雞和育成雞的危害十分嚴(yán)重，15～50日齡的雛雞發(fā)生率高，死亡率可達(dá)80%以上。耐過(guò)的雛雞生長(zhǎng)緩慢，發(fā)育不良。成雞多為帶蟲(chóng)者，增重量和產(chǎn)蛋受到一定影響。

1 流行病學(xué)

球蟲(chóng)的宿主有特異性，即侵襲雞的球蟲(chóng)不會(huì)侵襲火雞等其他家禽，而感染其他家禽的球蟲(chóng)不會(huì)感染雞。各品種的雞均有易感性，一日齡雛雞對(duì)本病也敏感，但有母源抗體保護(hù)，所以，10日齡以內(nèi)很少發(fā)病。15～50日齡發(fā)病率和死亡率很高，成年雞對(duì)球蟲(chóng)也是敏感的。球蟲(chóng)的卵囊抵抗力非常強(qiáng)，在土壤中可以保持生活期達(dá)4～9個(gè)月，在有樹(shù)蔭的運(yùn)動(dòng)場(chǎng)上，可達(dá)15～18個(gè)月。當(dāng)氣溫在22℃～30℃時(shí)一般只需要18～36 h，就可能成為感染性卵囊。卵囊對(duì)高溫和干燥的抵抗力較弱。病雞是主要傳染源。凡被帶蟲(chóng)雞污染過(guò)的飼料、飲水、土壤或用具等，都有卵囊存在；雞感染球蟲(chóng)的途徑主要是吃了感染性卵囊；人及其衣服、用具等可以成為機(jī)械性傳播者。蒼蠅、甲蟲(chóng)、蟑螂、鼠類和野鳥(niǎo)都可成為機(jī)械傳播媒介。當(dāng)存有帶蟲(chóng)雞（傳染源）并有傳染性卵囊時(shí)，就會(huì)爆發(fā)球蟲(chóng)病。發(fā)病時(shí)間與氣溫、雨量有密切關(guān)系，通常在溫暖的月份流行。室內(nèi)溫度高達(dá)30℃～32℃，濕度80%～90%時(shí)，最易發(fā)病。外界環(huán)境和飼養(yǎng)管理，對(duì)球蟲(chóng)病的發(fā)生有重大關(guān)系。天氣潮濕多雨，雛雞過(guò)于擁擠，運(yùn)動(dòng)場(chǎng)積水，飼料中缺乏維生素A、維生素K以及日糧配備不當(dāng)?shù)?，都是本病流行的誘因。

2 臨床癥狀

（1）急性型：急性型病程為2～3周，多見(jiàn)于雛雞。發(fā)病初期精神沉郁，羽毛松亂，不愛(ài)活動(dòng)；食欲廢絕，雞冠及可視黏膜蒼白，逐漸消瘦；排水樣稀便，并帶有少量血液。若是盲腸球蟲(chóng)，則糞便呈棕紅色，以后變成血便。雛雞死亡率高達(dá)100%。

（2）慢性型：慢性型多見(jiàn)于2日齡～4月齡的雛雞或成雞，癥狀類似急性型，但不大明顯。病程也較長(zhǎng)，拖至數(shù)周或數(shù)月。病雞逐漸消瘦，產(chǎn)蛋減少，間歇性下痢，但較少死亡。

3 材料與方法

3.1 卵囊的分離與純化

以1×104/雞的劑量分別經(jīng)口感染兩周齡的無(wú)球蟲(chóng)雞，進(jìn)行大量繁殖，感染后7～8 d撲殺柔嫩艾米爾球蟲(chóng)感染雞，取其盲腸和糞便。盲腸用組織粉碎機(jī)打碎，調(diào) pH2.0，按2mg/ml的劑量加入胃蛋白酶，在39℃恒溫水箱消化1h，使卵囊盡量充分游離出來(lái)。糞便同消化好的盲腸依次200目、300目、400目銅篩過(guò)濾，濾液3 000 rpm，10 min沉淀，棄去上清液，在沉淀中加入1.1 mol/L蔗糖溶液再次3 000 rpm離心5 min，離心管上層漂浮的白色塞子狀物即為卵囊，將卵囊撈入小于0.5 mol/L蔗糖溶液中，離心沉淀充分洗滌，除去比卵囊小的雜質(zhì)，最后加入5%次氯酸納，在4℃作用10min，反復(fù)充分洗滌除去NaOCl和小雜質(zhì)，即得到純化的未孢子化卵囊，備用。

3.2 GSNO的配制 按Stefan F介紹的方法[4]

3.3 卵囊的處理

3.3.1 未孢子化卵囊處理

取未孢子化卵囊用GSNO處理，另取等量的未孢子化卵囊作為對(duì)照

3.3.2 孢子化卵囊的處理

用常規(guī)方法將卵囊孢子化，使得孢子化率達(dá)90%以上，分為兩部分，一部分用GSNO處理，一部分作為對(duì)照

3.3.3 將藥物處理過(guò)的卵囊離心去除GSNO，用PBS清洗3次。

3.3.4 將以上處理過(guò)的卵囊濃縮至2.0×107/ml，移入Ependorf管中，分別加入10ulDTT、10ulPMSF、10ulEDTA，加入PBS至終體積為1ml。將盛有濃縮卵囊的離心管置于冰浴中，用DYNATEC超聲波裂解器打碎卵囊，相對(duì)輸出功率為20%，每循環(huán)99下，共8個(gè)循環(huán)，直至鏡檢無(wú)完整卵囊為止，而后用低溫超速離心機(jī)，4 ℃，15 000 rpm，離心30 min，取上清液分別裝于0.5 ml離心管中，冷藏備用（最好馬上應(yīng)用）。

3.4 電泳試劑的配置

凝膠：分別配制5.6%和7%分離膠，見(jiàn)附錄

（1）1mol/l HCl 48.0ml TEMED 36.6g Tris 0.23ml

（2）Acr 28.0g Bis 0.735g

（3）過(guò)硫酸胺 0.14g

（4）1mol/l HCl 48.0mlTris 5.98g TEMED 0.46ml

（5）Acr 10.0g Bis 2.5g

（6）核黃素 4.0mg

（7）蔗糖 40.0g

①7%分離膠 1份1號(hào)，3份2號(hào)，4份3號(hào)②5.6%分離膠2份1號(hào)，1份2號(hào)，2份3號(hào)

③5%濃縮膠1份4號(hào)，4份5號(hào)，1份6號(hào)，2份7號(hào)

3.5 電泳操作方法

3.5.1 制 膠

裝好電泳槽，在梳子下端的玻璃板處作一標(biāo)記。用熔化狀態(tài)的1%瓊脂封板，將現(xiàn)配置的聚丙酰胺凝膠迅速注入玻璃板內(nèi)，切勿產(chǎn)生氣泡。然后在膠面上輕鋪一層1cm高的水層，室溫下進(jìn)行聚合，出現(xiàn)明顯的界面后，濾紙吸掉水層，灌入濃縮膠5%，插入梳子，室溫下聚合1h。待聚合后撥出梳子，用去離子水沖洗加樣孔，充分洗滌干凈，加滿電極緩沖液待用

3.5.2 電泳

用pH8.0，0.05mol/l Tris-甘氨酸作電極緩沖液，以0.01溴酚蘭作指示劑，恒壓160伏電泳，溴酚蘭至板底1cm高時(shí)，停止電泳。

3.5.3 保溫顯色

電泳完畢后，取出膠版放入大平皿中，注入新鮮配置的酶顯色液，置于37℃溫箱避光保存60 min至過(guò)夜，待酶帶出現(xiàn)后，洗掉顯色液，加入酶固定液固定24 h，觀察結(jié)果拍照和繪制圖譜。

4 結(jié)果

4.1 卵囊分離純化及孢子化情況

圖1 未孢子化卵囊

圖2 孢子化卵囊

4.2 電泳及活性染色結(jié)果

圖3 LDH同工酶譜

圖4 G-6-PD同工酶譜

a為GSNO處理過(guò)的孢子化卵囊 A為GSNO處理過(guò)的孢子化卵囊

b為GSNO處理過(guò)的未孢子化卵囊 B為GSNO處理過(guò)的未孢子化卵囊

c對(duì)照組的孢子化卵囊. C對(duì)照組的孢子化卵囊

d對(duì)照組的未孢子化卵囊. D對(duì)照組的未孢子化卵囊

非變性PAGE對(duì)照結(jié)果表明：GSNO處理未孢子化及孢子化卵囊，均不能影響與球蟲(chóng)有氧代謝中乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）的活性，藥物處理與對(duì)照之間的電泳圖譜一致，說(shuō)明GSNO對(duì)球蟲(chóng)的影響力表現(xiàn)在其他某些方面。

5 治療

治療球蟲(chóng)病的藥物很多，常用的藥物包括：氨丙啉：氨丙啉毒性小，預(yù)防量為飼料添加40～250 mg/kg，連用7 d，隨后將濃度減半，再用14 d?；前范籽趺茑け然前范籽趺茑ざ拘孕。A(yù)防量為飼料或飲水中加入0.05%連用6d；治療量為預(yù)防量的倍量混飼或飲水連續(xù)3～7d。氯苯胍 氯苯胍反應(yīng)小，飼料拌入35g/t混勻，連喂1～2個(gè)月。磺胺喹惡啉以間斷投藥治療為佳，0.1%混飼2～3d，停3d再用0.05%混飼2d。速丹（常山酮）速丹用量為3mg/ kg濃度混飼。

6 預(yù)防

雞舍要保持清潔干燥、通風(fēng)良好，及時(shí)清除糞便及潮濕的墊料。飼槽、飲水器、用具和棲架要經(jīng)常洗刷和消毒，減少感染機(jī)會(huì)。飼料中應(yīng)保持有足夠的維生素A和維生素K，以增強(qiáng)抵抗力，降低發(fā)病率。

7 討論

GSNO能完全抑制球蟲(chóng)卵囊的孢子化過(guò)程，而孢子化過(guò)程是一有氧呼吸過(guò)程，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)排除了GSNO對(duì)與呼吸有關(guān)LDH及G-6-PD活性抑制的可能性。

作為一種內(nèi)源性信號(hào)分子，GSNO是一種舒血管物質(zhì)，在與電子傳遞鏈中的血紅素作用過(guò)程中降低了呼吸活性，可導(dǎo)致細(xì)胞代謝率下降，影響線粒體的滲透性。

資料表明，NO可直接或間接地抑制線粒體的活性，表現(xiàn)在如下方面：

（1）細(xì)胞色素c氧化酶活性受到抑制：細(xì)胞色素c氧化酶之所以被NO抑制是由于Fe與NO結(jié)合成加合物，從而失去活性。

（2）在NO作用下烏頭酸酶形成二亞硝酰加合物，從而失去酶活性。

綜上所述，GSNO對(duì)球蟲(chóng)卵囊孢子化過(guò)程的抑制作用與線粒體呼吸過(guò)程有著密切的關(guān)系，在線粒體呼吸方面與GSNO作用關(guān)系的研究有著更為廣闊的前景，需要科研工作者不斷深入探討。

[1] 孔繁瑤.家畜寄生蟲(chóng)學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[2] 李德昌.畜禽球蟲(chóng)病及其防治[M].北京：金盾出版社，2003 .

[3] Biggs PM.The world of poultry disease[J].Avian Pathol，1982，（11）：281-300.